卷羽鹈鹕源大肠埃希菌和粪肠球菌的分离及耐药性试验

张佰莲 马 珺 刘群秀

(1.上海农林职业技术学院，上海，201699；2.上海动物园，上海，200335)

大肠埃希菌(Escherichiacoli)和粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)是动物和人的肠道中常见的条件致病菌[1]，在正常生理状态下不会引起发疾病，而一旦宿主机体的免疫功能受到抑制，则会引起多种疾病[2-3]，威胁公共卫生安全。近年来，人和动物感染大肠埃希菌和粪肠球菌的病例不断出现，而抗菌药物的不合理使用又增强了2个菌种的耐药性，因此大肠埃希菌和粪肠球菌成为临床治疗的一大难题[4]。卷羽鹈鹕(Pelecanuscrispus)是我国一级重点保护野生动物，被世界自然保护联盟(IUCN)列为近危物种(NT)[5-6]。由于生境破坏，卷羽鹈鹕的野外种群数量大幅减少，上海动物园现有卷羽鹈鹕种群40余羽。徐正强等[7]报道了人工孵化和育雏的卷羽鹈鹕幼鸟常出现连续发病并死亡的情况，并对幼鸟感染大肠杆菌进行了初步研究。本研究采集上海动物园散放卷羽鹈鹕的粪便样本，进行大肠埃希菌和粪肠球菌的分离与鉴定，旨在深入探讨这2个菌种的耐药性，从而揭示野生动物源病原菌耐药传播规律及特征。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器

VITEK 2 Compact®全自动微生物分析系统及配套GN(革兰氏阴性)和GP(革兰氏阳性)细菌鉴定卡、比浊仪，法国生物梅里埃公司；Riboprinter®微生物基因指纹鉴定系统，美国杜邦公司；Sensititre®全自动菌液接种仪，美国赛默飞公司。

1.1.2 主要试剂

普通营养肉汤及营养琼脂，北京陆桥技术有限责任公司；麦康凯琼脂、肠球菌显色营养琼脂，美国BD公司；肠道杆菌和肠球菌药敏板测试盒，12 mL MH肉汤管，天津市金章科技发展有限公司；质量浓度0.85%的无菌氯化钠溶液。

1.1.3 菌株来源

大肠埃希菌和粪肠球菌：2019年8月在上海动物园鹈鹕样本中分离得到；质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922、粪肠球菌ATCC29212，美国标准菌种保藏中心。

1.2 方法

1.2.1 采样

以灭菌棉签拭子采集卷羽鹈鹕泄殖腔样品，置入运送培养基中。共采集9份。

1.2.2 细菌分离与纯化

大肠埃希菌：取拭子样品用接种棒直接接种于麦康凯琼脂平板，(36±1)℃培养18—24 h，挑取可疑菌落进行纯化培养，然后接种于营养琼脂平板，37℃培养12—24 h。

粪肠球菌：取拭子样品用接种棒直接接种于肠球菌显色琼脂平板，(36±1)℃培养18—24 h，挑取可疑菌落进行纯化培养，然后接种于营养琼脂平板，(36±1)℃培养16—18 h。

1.2.3 细菌鉴定

应用VITEK 2 Compact 全自动微生物鉴定系统，基于GN和GP细菌鉴定卡片对分离得到的菌株进行鉴定。对鉴定出的大肠埃希菌和粪肠球菌采用Riboprinter系统进行验证鉴定。再将全自动微生物生化法鉴定出的菌株与Riboprinter系统的鉴定结果进行对比，最终确认目标菌株。

1.2.4 药敏试验

对分离鉴定出的大肠埃希菌和粪肠球菌分别进行11大类13种抗菌药物和9大类12种抗菌药物药敏试验，测定结果按CLSI标准(2018版)确定判定临界值，划分为敏感(S)、中敏(I)和耐药(R)。最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)值的读取参照见表1和表2。

表1 大肠埃希菌对13种抗菌药物药敏试验临界值的判定值和质控范围

表2 粪肠球菌对12种抗菌药物药敏试验临界值的判定值和质控范围

2 结果与分析

2.1 细菌分离与鉴定

对9份粪便样本进行分离与纯化后，采用全自动微生物生化鉴定法与Riboprinter系统鉴定法的鉴定结果一致，分别分离鉴定出大肠埃希菌9株(分离率100%)，粪肠球菌7株(分离率77.8%)。

2.2 药敏试验结果

大肠埃希菌(9株)对氨苄西林(AB)、四环素(TE)和磺胺异恶唑(SF)的耐药性均较强，对阿莫西林/克拉维酸(A/C)、头孢噻呋(CEF)、多西环素(DO)、氟苯尼考(FFC)、氧氟沙星(OFL)和多黏菌素E(PME)均较为敏感(表3)；粪肠球菌(7株)对青霉素(PG)、红霉素(EM)、四环素(TE)的耐药性均较强，对链霉素(SM)、呋喃妥因(NF)、氯霉素(CM)和万古霉素(VM)均较为敏感(表4)。

表3 卷羽鹈鹕源大肠埃希菌对13种抗菌药物的药敏试验结果

表4 卷羽鹈鹕源粪肠球菌(7株)对12种抗菌药物的药敏试验结果

3 讨论

细菌耐药性的出现和耐药细菌的感染常使经验性治疗难以奏效，给兽医临床抗感染治疗带来极大的挑战，对动物的健康造成严重威胁。大肠埃希菌和粪肠球菌分别是表示抗菌药物耐药性水平的一种革兰氏阴性和阳性指示菌，其耐药谱是肠道菌群耐药基因水平传播评估的重要指标[8]。因此，十分有必要对卷羽鹈鹕分离的细菌和粪肠球菌的耐药性情况进行分析和研究。本研究选取上海动物园天鹅湖散放的卷羽鹈鹕源大肠埃希菌和粪球杆菌开展研究，根据指示菌的抗菌药物耐药水平，可进一步为兽医临床用药提供参考和基础数据。

研究表明，大肠埃希菌和粪球杆菌是肠道微生物群落中的重要菌属，通过基因重组，可以获得大量耐药基因和毒力基因，能够在人和动物的种群水平广泛传播[9-10]。通常情况下，抗生素的使用会对肠道菌群产生选择压力，增加肠球菌成为优势菌种的可能性[11]，即抗生素的不合理使用，加剧了大肠埃希菌和粪肠球菌的耐药性，加之其复杂的致病机制，使得这2个菌种发生感染的临床治疗更加困难。在上海动物园内，卷羽鹈鹕在天鹅湖岛屿上成群栖息，增加了细菌传播风险，应在日常管理中加强岛屿的清洁与卫生。

本研究中，大肠埃希菌对氨苄西林(AB)、四环素(TE)和磺胺异恶唑的耐药性较强，粪肠球菌(7株)对青霉素、红霉素、四环素的耐药性均较强。四环素作为临床上常用的抗生素，长期大量的使用造成了很多家畜体内细菌四环素耐药水平的增高[4]。如延边地区猪(Susscrofascrofa)源大肠埃希菌四环素耐药率为89%[12]，吉林地区猪源大肠埃希菌四环素耐药率为83.63%[13]，猪源粪肠球菌耐四环素的菌株比例也非常高[14-16]。本研究中，大肠埃希菌和粪肠球菌对四环素的耐药率均为100%，需要给予足够的重视。粪肠球菌的耐药性主要分为染色体介导的天然性耐药和染色体外遗传物质所诱导的获得性耐药，该菌的天然耐药性比临床上许多其他革兰氏阳性菌都要强[4]。本研究的部分结果与以往的研究相似，如大肠埃希菌对氨苄西林的耐药率高达70%[17-18]，粪肠球菌对青霉素的耐药率大于70.0%[19]。鉴于以上研究，建议经常开展菌种的耐药性检测，并依据药敏结果选择合适的抗生素，还应考虑抗生素种类及用量的合理选择，以更好地发挥作用。

致谢：本研究开展过程中得到上海动物园饲养科和兽医院的大力支持，在此一并表示感谢。