怀玉山高山马铃薯脱落酸和环境胁迫诱导蛋白基因的克隆和序列分析

尹明华，卢咏琪，罗怿文，潘巧玲，邱梦婷，苏 格，谭佳思，涂 慧，蔡 红，陈荣华

(1.上饶师范学院生命科学学院，江西 上饶 334001；2.上饶市药食同源植物资源保护与利用重点实验室，江西 上饶 334001；3.上饶市薯芋类作物种质保存与利用重点实验室，江西 上饶 334001；4.上饶农业技术创新研究院，江西 上饶 334001；5.上饶市红日农业开发有限公司，江西 上饶 334700)

【研究意义】高山蔬菜是指在高山地区海拔较高的区域种植的蔬菜，生态、错季、绿色、味美质优，深受广大消费者喜爱[1]。高山地区受海拔、地形以及地势影响导致其生境比较恶劣，如强日辐射、紫外线强烈、昼夜温差和湿度变化幅度较大、气压低、风强、生长周期短等[2]。因此，高山蔬菜需要选择抗逆好、抗病强、耐储存、经济价值高的蔬菜品种。怀玉山高山马铃薯是种植于怀玉山区一种高山马铃薯，俗称麻籽洋芋，为国家地理标志农产品，只能适于高山地区种植，移种到平原地区容易造成品种变异，无法保证其原有的品质和风味[3]。怀玉山高山马铃薯是药食兼优的高山蔬菜。食用，营养全面，味甘可口；药用，健脾利湿、降糖降脂[4]。2015年，马铃薯主粮化战略正式启动，马铃薯成为我国第四大主粮作物。在此主粮化背景下，做大做强怀玉山高山马铃薯产业具有重要的现实意义。【前人研究进展】高山蔬菜在高海拔逆境胁迫诱导因子的作用下会产生、传递和翻译高海拔逆境胁迫诱导信号，诱导相关基因转录表达，最终产生一些诱导蛋白以全面提高其防御能力[5]。植物激素信号是通过一个复杂的网络传递的，该网络具有相当大的串扰，有助于对环境响应进行所需的微调和调节，具生物活性的油菜素内酯(BL)和脱落酸(ABA)在内的油菜素类固醇激素(BR)主要参与植物的生长和发育以及植物的防御反应[6]。脱落酸被认为是控制植物对各种环境胁迫(包括水分亏缺、盐分、伤害和低温)适应性反应的常用介质，脱落酸在重要的作用不仅是介导一些生理过程，如种子萌发和在不利环境条件下，在遗传水平上也调节植物的适应性反应[7]，逆境胁迫发生时，ABA 与 ABA 结合蛋白快速结合，感知和传递环境信号，启动植物体内各种生理生化反应，提高植物抗逆能力[8]。【本研究切入点】目前在马铃薯克隆了“脱落酸、胁迫、成熟诱导基因”(Abscisic acid, stress, ripening inducible genes，ASR)[9-10]。关于马铃薯脱落酸与环境胁迫诱导蛋白(abscisic acid and environmental stress inducible protein)未见报道。【拟解决的关键问题】本研究从构建的怀玉山马铃薯转录组数据库中挑选脱落酸与环境胁迫诱导蛋白基因序列，采用 RT-PCR技术克隆脱落酸与环境胁迫诱导蛋白基因的全长序列，并对脱落酸与环境胁迫诱导蛋白基因结构和翻译产物进行生物信息学分析。此研究结果以期为进一步研究脱落酸与环境胁迫诱导蛋白在怀玉山高山马铃薯在高山高海拔环境逆境胁迫中调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

怀玉山高山马铃薯试管苗(上饶师范学院生命科学学院植物组织培养室提供)、Trizol 总 RNA 提取试剂、PCR 反应 2 × GoldStarTaqMasterMix 购 自 北 京 康 为 世 纪 公司；M-MLV cDNA 第一链合成试剂、PrimeScript®RT Reagent Kit With gDNA Eraser(Perfect Real Time)、PMD18-T vector 及 SYBR®Premix ExTaqTM II 均购自TaKaRa 公司；Gel Extraction Kit 购自 Omega公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α 由本实验室保存；其他常规试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 总 RNA 的提取和 cDNA 第一链的合成

用Trizol 试剂提取怀玉山高山马铃薯试管苗的总 RNA，提取步骤按说明书进行，使用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的浓度和完整性。以提取获得的 RNA为模版，按照 M-MLV cDNA 第一链合成试剂盒说明书合成 cDNA 第一链。逆转录引物用 Oligo(dT)18 Primer：5′-GGCCACGC GTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′，具体步骤按说明书进行。

1.3 怀玉山高山马铃薯脱落酸与环境胁迫诱导蛋白基因基因的克隆

利用怀玉山高山马铃薯试管苗转录组数据库筛选到脱落酸与环境胁迫诱导蛋白基因基因的核心片段，运用 Primer Premier 5.0 设计基因特异性引物(F：ATGGCACAATACGGCAACCA；R：TCAATGCATCCCAGGGATCTT)。PCR扩增条件：95 ℃ 2 min；(95 ℃ 30 s；54 ℃ 30 s；72 ℃ 4 min 30 s)(35个循环)；72 ℃ 10 min。PCR 产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳检测后，将含有目的基因的条带与 pMD19-T 载体连接并用热激法转化到感受态细胞E.coliDH5α，经鉴定正确的阳性转化子提取质粒送往上海生工进行测序。

1.4 生物信息学分析

按照张林等[11]方法对怀玉山高山马铃薯脱落酸与环境胁迫诱导蛋白基因进行氨基酸序列分析、理化性质分析、结构预测、功能分析。

2 结果与分析

2.1 怀玉山高山马铃薯RNA 提取

由图 1可以看出，RNA条带清晰，无色素、蛋白、糖类等杂质污染，28/23S亮度大于18/16S，浓度为602.00 ng/μL，总量为18.06 μg，RIN值=8.4，OD260/OD280=2.17，OD260/OD230=2.22，表明提取的RNA较为完整，质量较高，可以进行后续实验。

图1 怀玉山高山马铃薯总RNA电泳

2.2 怀玉山高山马铃薯脱落酸与环境胁迫诱导蛋白基因cDNA序列

由图2～4显示，通过PCR扩增技术，怀玉山高山马铃薯脱落酸与环境胁迫诱导蛋白基因cDNA总长度为423 bp，G+C 含量为52.25%。

图2 怀玉山高山马铃薯脱落酸与环境胁迫诱导蛋白基因PCR扩增

图3 怀玉山高山马铃薯脱落酸与环境胁迫诱导蛋白基因碱基组成

图4 怀玉山高山马铃薯脱落酸与环境胁迫诱导蛋白基因各碱基的比例

2.3 怀玉山高山马铃薯脱落酸与环境胁迫诱导蛋白氨基酸序列

由图5显示，Protparam预测怀玉山高山马铃薯脱落酸与环境胁迫诱导蛋白由140个氨基酸组成，分子量14 534.01 Da，等电点7.07，为亲水性蛋白。各氨基酸的数目和比例为Ala(A)(3，2.1%)、Arg(R)(5，3.6%)、Asn(N)(2，1.4%)、Asp(D)(7，5.0%)、Cys(C)(0，0.0%)、Gln(Q)(14，10.0%)、Glu(E)(9，6.4%)、Gly(G)(38，27.1%)、His(H)(7，5.0%)、Ile(I)(3，2.1%)、Leu(L)(1，0.7%)、Lys(K)(11，7.9%)、Met(M)(16，11.4%)、Phe(F)(0，0.0%)、Pro(P)(2，1.4%)、Ser(S)(7，5.0%)、Thr(T)(12，8.6%)、Trp(W)(0，0.0%)、Tyr(Y)(2，1.4%)、Val(V)(1，0.7%)、Pyl(O)(0，0.0%)、Sec(U)(0，0.0%)。带负电残基总数(Asp+Glu)为16，正电荷残基总数(Arg+Lys)为16。原子组成：碳(C)580，氢(H)942，氮(N)196，氧(O)210，硫(S)16；分子式：C580H942N196O210S16，原子总数：1944。消光系数：这种蛋白质不含任何Trp残基。经验表明这可能导致计算消光系数的误差超过10%。消光系数以M-1·cm-1为单位，在水中测量的280 nm处。外部系数2980，绝对值0.1%(= 1 g/L)0.205。估计半衰期所考虑序列的N端是M(Met)。估计半衰期为：30 h(哺乳动物网织红细胞，体外)。>20 h(酵母，体内)。>10 h(大肠杆菌，体内)不稳定指数：失稳指数(II)计算为34.82，这将蛋白质分类为稳定的。

图5 怀玉山高山马铃薯脱落酸与环境胁迫诱导蛋白氨基酸序列

脂肪指数15.36，总平均亲水性为-1.268。

2.4 怀玉山高山马铃薯脱落酸与环境胁迫诱导蛋白亲疏水性分析

从图6可知，高峰值(正值)的区域表示疏水的区域，而负值的“低谷”区域是亲水区域。疏水性结果分析表明，最大疏水值为0.3左右，在该多肽中说明该处的疏水性最强；亲水峰最大值为-3左右，整个蛋白质表现出高度的亲水性，说明该蛋白为亲水性蛋白质。

图6 怀玉山高山马铃薯脱落酸与环境胁迫诱导蛋白亲疏水值分布

2.5 怀玉山高山马铃薯脱落酸与环境胁迫诱导蛋白二级结构分析

由图7显示，GOR 预测显示其二级结构由α-螺旋(Alphahelix，Hh，21.43%)、β-片层(Extendedstrand，Ee，24.29%)、无规则卷曲(Randomcoil，Cc，54.29%)构成。从分布位点上来看，由图8显示，C端和N端含无规则卷曲、β-片层和α-螺旋，且无规则卷曲、β-片层和α-螺旋则散布于整个蛋白质中。

图7 怀玉山高山马铃薯脱落酸与环境胁迫诱导蛋白二级结构

蓝色代表 α-螺旋；红色代表β-片层；紫色代表不规则卷曲

2.6 怀玉山高山马铃薯脱落酸与环境胁迫诱导蛋白三级结构分析

由图9显示，SWISS-MODEL预测显示怀玉山高山马铃薯脱落酸与环境胁迫诱导蛋白的三级结构为单聚体。

图9 怀玉山高山马铃薯脱落酸与环境胁迫诱导蛋白三级结构

2.7 怀玉山高山马铃薯脱落酸与环境胁迫诱导蛋白亚细胞定位

图10显示，采用 Psort在线软件对怀玉山高山马铃薯脱落酸与环境胁迫诱导蛋白基因的表达部位进行预测，结果为定位于细胞核中的数量为10，细胞外的数量为2，细胞质中的数量为1，质膜中的数量为1，表明怀玉山高山马铃薯脱落酸与环境胁迫诱导蛋白主要存在细胞核中。

2.8 怀玉山高山马铃薯脱落酸与环境胁迫诱导蛋白系统进化分析

从图11可见，怀玉山高山马铃薯与Solanumtuberosum(马铃薯)abscisic acid and environmental stress inducible protein TAS14-like、S.tuberosum(马铃薯)TAS14肽、S.tuberosum(马铃薯)abscisic acid and environmental stress inducible protein TAS14和Vibrioparahaemolyticus(副溶血性弧菌)hypothetical protein(假定蛋白)在一个大分支下，这说明怀玉山高山马铃薯脱落酸与环境胁迫诱导蛋白在进化上与马铃薯和副溶血性弧菌的亲缘关系较近，尤其是与马铃薯(S.ltuberosum)abscisic acid and environmental stress inducible protein TAS14-like在进化上具有最高的亲缘关系。

图11 怀玉山高山马铃薯脱落酸与环境胁迫诱导蛋白系统进化分析

3 讨 论

脱落酸(ABA)可以诱导一系列基因表达介导植物对环境的反应压力[12]。大麦(HordeumvulgareL.)的一个早期ABA诱导基因HVA22与其他ABA反应基因如LEA(晚期胚胎发生丰富)和RAB(对ABA反应)基因几乎没有同源性，ABA和环境因素可诱导HVA22在营养组织中的表达压力，如寒冷和干旱[13]。干旱胁迫下智利番茄叶片中鉴定出一个渗透胁迫和脱落酸应答的内切酶(EC 3.2.1.14)基因家族成员，966 bp全长cDNA(命名为pcht28)编码一种带有氨基末端信号肽的酸性几丁质酶前体，预测成熟蛋白含有229个氨基酸残基，相对分子质量24 943，pI值6.2。序列分析表明，pcht28与番茄和烟草中的Ⅱ类几丁质酶(EC 3.2.1.14)具有高度同源性。pcht28蛋白在大肠杆菌中的表达证实了它确实是一种几丁质酶。pcht28编码的几丁质酶除了具有一般的防御功能外，还可能在水分胁迫下的植物发育或保护植物免受病原菌侵染方面发挥特殊作用[14]。脱落酸、胁迫和成熟诱导蛋白(ASR)是一类低分子量的植物特异性蛋白，芒果ASR基因的全长cDNA序列(MiASR)包含516个核苷酸的开放阅读框(ORF)，编码172个氨基酸残基，可能参与芒果果实成熟和采后生理[15]。旱胁迫和脱落酸诱导的番茄基因le16包含单个开放阅读框能够编码12.7 kDa的多肽，富含亮氨酸、甘氨酸和丙氨酸，等电点为8.7，氨基末端是疏水性的，具有信号序列的特征，其靶向多肽从细胞质中输出[16]。在拟南芥中，脱水反应基因rd22的诱导是由脱落酸(ABA)介导的，rd22启动子的67 bp DNA片段足以用于脱水和ABA诱导的基因表达，获得了一个编码MYC相关DNA结合蛋白的cDNA(rd22BP1)，编码一个68 kd蛋白，具有典型的碱基区螺旋环螺旋亮氨酸拉链基序的DNA结合域。另外还获取一个干旱和ABA诱导的基因可以编码MYB相关蛋白ATMYB2，实验证明rd22BP1(MYC)和ATMYB2(MYB)蛋白在rd22基因的脱水和ABA诱导表达中都起转录激活作用[17]。利用噬菌体原位杂交技术，从干旱处理小麦幼苗cDNA文库中克隆了一个水分胁迫诱导基因W89，全长cDNA 2392 bp，包含一个1896 bp的开放阅读框(ORF)，编码631个氨基酸蛋白，保守区为DUF248(pfam03141)，W89与水稻脱水反应蛋白BAD67956的同源性为66%[18]。经低温、干旱、盐胁迫和伤害胁迫处理的紫花苜蓿幼苗，不经高温处理，会诱导产生与代表性cDNA相对应的RNA(pUM90-1)，ABA和ABA类似物可以迅速诱导pUM90-1基因的表达，这些cDNA克隆可编码一组可被ABA和多种环境胁迫诱导的蛋白质，并对应于一个新的植物基因家族，即ABA和环境胁迫诱导基因[19]，并且其中一种苜蓿ABA和环境胁迫诱导基因的初级结构被确定[20]。ABA和环境胁迫诱导基因Tas14在番茄储存早期可以诱导表达，Tas14基因也被认为是在ABA或环境胁迫下积累，可以与含有酸性磷脂的脂质囊泡结合，清除羟自由基或对脂质膜具有抗过氧化保护作用[21]。马铃薯防御激素反应的转录参考图谱也表明，ABA的应用对马铃薯转录物丰度的影响最大，ABA共诱导492个基因，下调264个基因，植物中参与ABA途径的基因被强烈上调，例如ABA和环境胁迫诱导蛋白TAS14(DMG400003530)上调1720倍[6]。本试验结果进一步充实了这个研究结果。在本研究中，怀玉山高山马铃薯脱落酸与环境胁迫诱导蛋白基因cDNA总长度为423 bp，G+C 含量为52.25%；怀玉山高山马铃薯脱落酸与环境胁迫诱导蛋白由140个氨基酸组成，分子量14 534.01Da，等电点7.07，为亲水性蛋白；怀玉山高山马铃薯脱落酸与环境胁迫诱导蛋白二级结构由α-螺旋(21.43%)、β-片层(24.29%)、无规则卷曲(54.29%)构成；怀玉山高山马铃薯脱落酸与环境胁迫诱导蛋白的三级结构为单聚体；怀玉山高山马铃薯脱落酸与环境胁迫诱导蛋白主要存在细胞核中；怀玉山高山马铃薯脱落酸与环境胁迫诱导蛋白在进化上与马铃薯和副溶血性弧菌的亲缘关系较近，尤其是与马铃薯(Solanumltuberosum)abscisic acid and environmental stress inducible protein TAS14-like在进化上具有最高的亲缘关系。