利用生物信息方法寻找与绵羊脂代谢相关的候选基因

肖 成，薛佳佳,2，王 晶,3，柳俭强，于永生，张立春，马惠海，金海国*，曹 阳*

（1.吉林省农业科学院，吉林公主岭 136100 2.吉林农业大学动物科技学院，吉林长春 130000；3.延边大学农学院，吉林延吉 133000）

随着居民生活水平的提高，高品质羊肉越来越受到欢迎。遗传因素是影响肉质性状的重要因素之一，提高肌内脂肪含量能够显著提升肉质，而肌内脂肪含量受到脂肪细胞分化及脂滴积累的影响。因此，探究脂肪细胞分化形成的机制，寻找新的调控基因对于提高肌内脂肪含量有重要作用。

参与绵羊脂代谢的基因众多且复杂，不易找到相关的新调控基因，需借助生物信息学方法进行寻找。第2代测序技术可以高效准确地检测特定状态下细胞或组织全部的转录本信息，因此适合研究不同组织器官或发育阶段之间的差异表达基因[1]。目前，第2 代测序技术快速发展并已被广泛应用，大量测序数据被上传到公共平台。利用公共数据库进行数据挖掘，可以快速寻找到与脂代谢相关的预测基因。通过动物实验验证，可以快速锁定脂代谢相关候选基因，减少大量前期工作，缩短实验时间。本实验通过生物信息相关网站及分子实验结合方式，探究影响绵羊脂肪细胞分化的新标志基因，以期为深入探索绵羊脂代谢调控机理提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 实验选择2 月龄健康雄性绵羊（双乾肉羊）1 只，屠宰后取其腹股沟脂肪组织，用于分离绵羊前体脂肪细胞。选择体重相近（50 kg）的6 月龄健康雄性绵羊（杜寒杂交羊子一代）8 只，屠宰后取其肌肉、脂肪、十二指肠、小肠、心、肝、胃组织，置于冻存管中液氮保存，用于提取组织总RNA。实验动物为吉林省农业科学院动物生物技术研究所饲养。

1.2 主要试剂与仪器 蛋白裂解液购自索莱宝生物公司；Western 相关仪器以及试剂均为实验室之前保存；细胞培养皿来自corning 公司；细胞分化诱导剂（胰岛素、地塞米松）、PBS 缓冲液、细胞分离试剂（胰蛋白酶、胶原酶）等均购自Sigma 公司；RNA 提取试剂TRIzol购自Invitrogen 公司；PCR 预混酶购自康为世纪生物公司；反转录试剂盒、DL2000 Maker 购自TaKaRa 生物有限公司；PCR 引物及测序服务由苏州金唯智生物科技有限公司提供；LightCycler 480 SYBR Green I Master由罗氏（中国）公司提供。

1.3 实验方法

1.3.1 候选基因选择 利用NCBI 网站（www.ncbi.nlm.nih.gov）选择GEO Data Sets 项目，输入与脂肪细胞相关的关键词，寻找与脂代谢相关的公共测序数据3 组，分别为GSE97241、GSE90580、GSE51905。利用网站公布测序数据自带的分析程序GEO2R 截取前250 个差异表达基因，然后将3 组测序数据合并，使用Venn 图找到共有的差异表达基因，即富含半胱氨酸酸性分泌蛋白类似物1（Secreted Protein Acidic and Rich in Cysteine Like 1，SPARCL1）。

1.3.2 提取8 只绵羊各组织总RNA 利用液氮将目的组织研磨成粉末，按照TRIzol 说明书指示方法提取各组织总RNA。紫外分光光度计检测RNA 浓度，琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。合格后利用TaKaRa 反转录酶体外合成cDNA，反应体系：Total RNA 500 ng，5×Master Mix 2 μL，RNase Free ddH2O 补充到 10 μL。反应条件：37℃ 15 min，85℃ 5 s，12℃保存。双蒸水将cDNA 稀释10 倍，用于实时荧光定量PCR 检测。

1.3.3 分离绵羊前体脂肪细胞并诱导 屠宰2 月龄绵羊，无菌取腹股沟处白色脂肪组织，剔除筋膜及血块，将组织剪成1 mm3方块。胶原酶II 消化组织1 h，期间每5 min 混匀1 次，消化后液体经200 目以及400 目滤网，过滤出未消化的组织及杂细胞。1 500 r/min 离心15 min 弃上清，完全培养液重悬细胞并接种到60 mm培养皿中。细胞6 h 贴壁，12 h 换液，除掉杂细胞及未贴壁细胞。每48 h 换液，待细胞长满培养皿，胰蛋白酶消化细胞，传代培养。第3 代细胞进行体外诱导，胰岛素、地塞米松以及IBMX 混合培养液作为诱导I 液诱导细胞，48 h 换诱导II 液（含胰岛素的完全培养基），48 h 后换完全培养基。继续培养直到显微镜下看到细胞出现脂滴，油红O 染色验证成熟的脂肪细胞。选择细胞分化前及分化后2 个时期提取RNA 和蛋白，用于后续实验。

1.3.4 引物设计及验证 根据Genbank 中绵羊SPARCL1基因mRNA 序列（XM_004009982.3）以及内参基因GAPDH序列（NM_001190390.1）利用Primer 5 软件设计实时荧光定量RCR 引物序列，引物具体信息见表1。普通PCR 方法检测引物特异性。PCR 反应体系20 μL：预混酶10 μL、上下游引物（10 pmol/μL）各0.5 μL、模板 1 μL、ddH2O 8 μL；扩增条件为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，退火温度30 s，72℃延伸温度8 s，35个循环，72℃延伸8 min，4℃保存。产物经琼脂糖凝胶电泳实验，条带单一的PCR 引物可用于定量实验。

表1 SPARCL1 基因引物序列

1.3.5 实时荧光定量PCR 和Western Blot 检测 RTqPCR 体系为20 μL：Light Cycler 480 SYBR Green I Master（2×）10 μL、ddH2O 8 μL、cDNA 1 μL、上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL。反应程序：95℃ 5 min，95℃10 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 20 s，共40个循环，95 ℃ 5 s，65 ℃ 1 min，40 ℃ 10 s，每组 实验重复3 次。Roche Lightcycler 480 软件进行数据分析。Western Blot 检测，裂解液裂解细胞30 min 获得细胞蛋白，100℃沸水煮蛋白10 min，使其变性。制备分离胶与浓缩胶，待胶凝固后，将蛋白注入胶孔20 μL，电压80 V，20 min，待蛋白跑到分离胶后，换电压120 V，40 min，跑胶结束后进行转膜。将分离胶上蛋白转移到PVDF 膜上，200 mA 条件下转膜60 min，TBST 洗5 min 后，用含有5% 脱脂奶粉的封闭液封闭膜2 h。TBST 洗3 次，每次5 min，一抗4℃摇过夜。第二天TBST 洗3 次，每次5 min，二抗室温摇2 h，TBST 洗3 次，每次5 min，显色液孵育1 min 后照相。

1.4 统计分析 每组实验重复3 次，数据以“平均值±标准差”表示，采用GraphPad Prism 软件作图，利用SPSS 17.0 对数据进行t检验或单因素方差分析，显著性水平定为P＜0.05，极显著水平定为P＜0.01。

2 结果

2.1SPARCL1基因在绵羊各组织的表达差异 如图1所示，SPARCL1基因在绵羊各组织的表达谱中，在绵羊脂肪组织中表达最高。

图1 SPARCL1 基因在绵羊各组织表达谱

2.2SPARCL1基因在不同绵羊个体脂肪组织中的表达差异 如图2 所示，SPARCL1基因在7 号个体绵羊脂肪组织表达量最高。经实验室前期测定，7 号绵羊的耗料增重比最高（表2）。

图2 SPARCL1 基因在不同绵羊脂肪组织中表达趋势

表2 不同个体绵羊耗料增重比

2.3 体外培养脂肪细胞并诱导 如图3 所示，成熟脂肪细胞内脂滴能够被染成红色以鉴定为脂肪细胞。脂肪细胞通常会聚集在一起，脂滴形成串珠形态。

图3 油红O 染脂肪细胞图

2.4SPARCL1基因在绵羊脂肪细胞分化过程的表达差异如图4 所示，细胞分化后SPARCL1基因相对表达较细胞分化前显著升高（P≤0.05）。Western Blot 蛋白免疫印迹结果也具有相同趋势（图5）。

图4 SPARCL1 基因脂肪细胞分化前后期表达趋势

图5 SPARCL1 蛋白在脂肪细胞分化前后期表达趋势

3 讨 论

本研究通过生物信息学方法寻找到绵羊脂代谢相关新的调控基因SPARCL1。该候选基因源自小鼠脂肪细胞测序数据，因此需要在绵羊个体进行验证。实验发现SPARCL1基因不仅在绵羊脂肪组织中高表达，且在不同绵羊个体脂肪组织中的表达也存在差异。SPARCL1基因在饲料利用率最高的绵羊个体脂肪组织中表达最高。这也间接说明SPARCL1基因可能对于饲料利用率或者脂肪增殖方面具有影响。脂肪细胞分化前期与后期2 个阶段，SPARCL1基因在分子水平以及蛋白水平均出现显著变化且趋势相同，说明SPARCL1基因可能参与脂肪细胞分化，其具体机制值得研究。

SPARCL1 属于SPARC 家族成员，为具有分泌功能的基质糖蛋白。SPARCL1 是介导细胞基质相互作用的黏附分子，参与机体多项生理过程，如细胞黏附、增殖、分化、迁移、成熟等[2]。SPARCL1基因在动物胚胎期以及组织受伤重塑时高表达，恶性肿瘤组织中SPARCL1基因表达显著低于正常组织。有研究发现，转染外源过表达SPARCL1质粒后，肿瘤细胞迁移、侵袭、生长受到抑制[3]。目前SPARCL1基因在癌症预防、治疗等方面研究较多，研究也表明SPARCL1基因是与肿瘤相关的重要因子[4-9]，具有肿瘤抑制作用[10]。最近有研究发现，SPARCL1基因能够抑制小鼠前体脂肪细胞分化，参与脂代谢过程[11]，这也坚定了本课题组对于SPARCL1基因在绵羊脂代谢方面进行深入研究的信心。

4 结 论

本实验利用NCBI 网站公共测序数据GSE97241、GSE90580、GSE51905，取3 组共有差异表达基因SPARCL1作为绵羊脂代谢相关候选基因，结果显示SPARCL1基因在绵羊脂肪组织中高表达，同时在饲料转化率高的绵羊个体脂肪组织中显著表达。分子以及蛋白水平均检测出SPARCL1基因在脂肪细胞分化前后出现差异表达。