铁必康胶囊的质量标准提高研究

金 丽 杭 娟 张晓丹

无锡联勤保障中心药品仪器监督检验站，江苏 南京 210002

铁必康胶囊由磁石、骨碎补、葛根、黄精、枸杞子、熟地黄、漏芦、石菖蒲和酒大黄9味药组成，为上海长征医院的非标准复方制剂，具有补肾健脾、益气活血的作用。临床主要用于治疗慢性缺铁性耳聋以及与铁代谢障碍相关的各类非感染性、非遗传性感音神经性耳聋或梅尼埃病引起的耳鸣、耳聋与眩晕等。该制剂原质量标准过于简单，仅设置了骨碎补和葛根的薄层色谱鉴别，且未设置含量测定项。为了更有力地控制该制剂的内在质量，提高质量标准，在原标准基础上，本文修订了葛根的薄层色谱鉴别，删除了原标准中骨碎补的鉴别，并新增了大黄和枸杞子的鉴别。同时，以该制剂中葛根的主要有效成分——葛根素为指标，新增高效液相色谱法测定其含量，控制其内在质量，以保证临床用药的有效性。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司)、MS105 电子天平、AL104电子天平(Mettler Toledo)、KQ-250E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、HH-6数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)。

1.2 试药 葛根对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：121551-201103)、大黄对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：120984-201202)、枸杞子对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：121072-201410)、葛根素对照品(纯度：95.5%，中国食品药品检定研究院，批号：110715-201318)、大黄素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110756-200110)、大黄酚对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110796-201319)；铁必康胶囊(规格：0.6 g/粒，上海长征医院，批号：171026，170912，170916)，阴性对照样品由上海长征医院提供；硅胶G板(青岛海洋化工厂分厂)；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

2.1.1 葛根的鉴别[1-3]取本品10粒的内容物，加甲醇50 mL，超声30 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水30 mL使溶解，加等量乙酸乙酯提取2次，弃去乙酸乙酯液，水层再加等量的正丁醇振摇提取2次，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇5 mL使溶解，作为供试品溶液。另取葛根对照药材0.2 g，加甲醇10 mL，放置2 h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇0.5 mL使溶解，作为对照药材溶液。取按样品同样工艺制备而成的缺葛根的阴性样品6 g，按照供试品溶液的制备方法制备缺葛根的阴性对照溶液。照薄层色谱法[4](通则0502)试验，吸取供试品溶液、阴性对照溶液各5 μL，对照药材溶液1 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(7∶2.5∶0.25)为展开剂，展开，取出，晾干，置氨蒸气中熏15 min，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰。结果如图1所示。

2.1.2 大黄的鉴别[1,3,5]取本品10粒的内容物，加甲醇50 mL，浸渍1 h，超声30 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加20 mL水使溶解，加盐酸2 mL，置水浴中加热30 min后，立即冷却，用乙醚振摇提取2次，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取大黄对照药材0.1 g，同法制成对照药材溶液。取大黄酚和大黄素对照品适量，加甲醇分别制成每1 mL含0.5 mg的对照品溶液。取按样品同样工艺制备而成的缺大黄的阴性样品6 g，按照供试品溶液的制备方法制备缺大黄的阴性对照溶液。照薄层色谱法[4](通则0502)试验，吸取供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL、大黄对照药材溶液1 μL、大黄酚对照品溶液2 μL、大黄素对照品溶液1 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(30～60 ℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365 nm下检视。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点；置氨蒸气中熏后，日光下检视，显相同的红色斑点，阴性对照无干扰。结果如图2所示。

2.1.3 枸杞子的鉴别[1,6]取本品10粒，内容物加水50 mL，煮沸10 min，离心(3000转/min)10 min，取上清液，加乙酸乙酯振摇萃取2次，每次30 mL，分取乙酸乙酯液，浓缩至2 mL，作为供试品溶液。另取枸杞子对照药材0.5 g，加水35 mL，煮沸15 min，放冷，滤过，滤液用乙酸乙酯振摇萃取2次，每次15 mL，分取乙酸乙酯液，浓缩至1mL，作为对照药材溶液。取按样品同样工艺制备而成的缺枸杞子的阴性样品6 g，按照供试品溶液的制备方法制备缺枸杞子的阴性对照溶液。照薄层色谱法[4](通则0502)试验，吸取对照药材溶液5 μL、供试品溶液10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(15∶8∶1.5)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365 nm下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰。结果如图3所示。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件[7-12]色谱柱：Dubhe C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇-水(25∶75)；检测波长：250 nm ；理论塔板数按葛根素峰计算不低于2500。

2.2.2 溶液的制备 ①对照品储备液:称取葛根素对照品约10 mg，精密称定，置于25 mL量瓶中，加稀乙醇溶解稀释至刻度，摇匀，即得。②对照品溶液：精密量取对照品储备液2 mL，置于10 mL量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。③供试品溶液：取装量差异项下的本品内容物，混匀，研细，取约0.6 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，称定重量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)1 h，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。④阴性对照溶液:按处方比例称取缺葛根的其余药味，按铁必康胶囊制备工艺制备阴性样品，然后按2.2.2③项下方法操作，制备阴性对照溶液。

2.2.3 专属性试验 取上述对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各5 μL，按2.2.1项下色谱条件进行测定，记录色谱图，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的保留时间处有同一色谱峰，而阴性对照溶液在相应保留时间处则无色谱峰出现，表明铁必康胶囊中其他成分对葛根素的测定无干扰。结果如图4所示。

2.2.4 线性关系的考察 取葛根素对照品约12.5 mg，精密称定(12.48 mg)，置50 mL容量瓶中，加稀乙醇溶解稀释至刻度，摇匀，作为葛根素对照品储备液。分别精密葛根素储备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置10 mL容量瓶中，用稀乙醇稀释至刻度，按2.2.1项下色谱条件进行测定，以对照品浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归，得到回归方程为：

Y=21113X-3620.6，r=1.0000，n=6

结果表明：葛根素浓度在23.84～143.02 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.2.5 精密度试验 取葛根素对照品约10 mg，精密称定(9.51 mg)，置50 mL容量瓶中，加稀乙醇溶解稀释至刻度，摇匀，作为葛根素对照品储备液。精密量取葛根素储备液5.0 mL，置10 mL容量瓶中，用稀乙醇稀释至刻度，按2.2.1项下色谱条件连续进样6次，葛根素峰面积的RSD为0.28%。结果表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 取样品(批号：170916)，按2.2.2③项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件测定，分别于0、2、4、6、8、10和12 h进样，记录葛根素峰面积，得峰面积的RSD为0.60 %，结果表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.2.7 重复性试验 取同一批号样品6份(批号：170916)，按2.2.2③项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件测定，记录葛根素峰面积，按外标法计算葛根素的含量，测得其平均含量为7.2911mg·g-1，RSD为0.31%(见表1)，结果表明本方法重复性良好。

表1 重复性试验结果

2.2.8 加样回收率 称取6份已知含量的样品(批号：170916，葛根素含量为7.2911 mg·g-1)，各约0.3 g，精密称定，分别加入浓度为0.1906 mg·mL-1的对照品溶液(精密称取葛根素对照品22.88 mg，置100 mL量瓶中，加稀乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得)10 mL，按2.2.2③项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件测定，记录葛根素峰面积，按外标法计算葛根素的含量，结果见表2。

表2 加样回收试验结果

2.2.9 耐用性试验 流动相比例的考察：取样品(批号：170916)，按2.2.2③项下方法制备供试品溶液，调节流动相比例，按2.2.1项下色谱条件测定，记录葛根素峰面积，按外标法计算每1 g样品中葛根素的含量(mg/g)。结果表明，流动相中甲醇的比例增大对含量测定结果影响相对更大些，但基本能刚好满足样品检测的要求，见表3。

色谱柱的考察：取样品(批号：170916)，使用不同品牌的色谱柱，按2.2.2③项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件测定，记录葛根素峰面积，按外标法计算每1 g样品中葛根素的含量(mg/g)。结果表明，不同色谱柱对含量测定结果影响很小，见表4。

表3 流动相比例试验结果

表4 流动相比例试验结果

柱温的考察：取样品(批号：170916)，在不同柱温下，按2.2.2③项下方法制备供试品溶液，按2.4.1项下色谱条件测定，记录葛根素峰面积，按外标法计算每1 g样品中葛根素的含量(mg/g)。结果表明，不同的柱温对含量测定结果影响很小，见表5。

表5 柱温试验结果

流速的考察：取样品(批号：170916)，在不同流速下，按2.2.2③项下方法制备供试品溶液，按2.4.1项下色谱条件测定，记录葛根素峰面积，按外标法计算每1 g样品中葛根素的含量(mg/g)。结果表明，不同的流速对含量测定结果影响很小，见表6。

表6 流速试验结果

以上结果表明该方法有较好的耐用性。

2.2.10 含量测定 取3批样品，按2.2.2③项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件测定，记录葛根素峰面积，按外标法计算含量。结果见表7。

表7 铁必康胶囊中葛根素含量测定结果

3 讨论

3.1 薄层色谱鉴别

3.1.1 磁石 磁石是一种氧化物类矿物尖晶石族磁铁矿，主含四氧化三铁，因此，本试验尝试利用铁盐的鉴别反应对其鉴别。参照文献[13]和铁盐的一般鉴别方法[4](通则0301)，对磁石进行化学鉴别。实验结果发现，阴性样品对磁石的鉴别存在干扰。因此，磁石未能纳入质量标准。

3.1.2 骨碎补 原质量标准中设置了骨碎补的薄层色谱鉴别，但通过实验发现，供试品色谱中未能检出相应斑点。参考现行版药典[1]和相关文献[14-16]，采用多种预处理方法(正丁醇萃取、过大孔树脂柱等)尝试对制剂中的骨碎补进行薄层色谱鉴别，均未能检出相应斑点。这可能与骨碎补主成分柚皮苷的性质有关。柚皮苷在水中的溶解度为0.1%，75℃时也仅可达10%，结合该制剂水煮醇沉的生产工艺，考虑可能柚皮苷的转移率过低，难以鉴别。因此，骨碎补未能纳入质量标准。

3.1.3 石菖蒲和黄精 石菖蒲和黄精为方中臣药，原标准均未建立它们的薄层色谱鉴别方法。参考文献和药典收载的石菖蒲和黄精相关鉴别方法[1,17-18]，采用对照药材法，对该制剂中的石菖蒲和黄精进行了鉴别。但实验结果发现，供试品色谱中未能检出与相应对照药材色谱相对应的斑点。因此，石菖蒲和黄精均未能纳入质量标准。

3.2 含量测定

3.2.1 指标成分的选择 铁必康胶囊处方中的君药为磁石和骨碎补，磁石是一种氧化物类矿物尖晶石族磁铁矿，主含四氧化三铁，药典收载的磁石含铁量的测定方法为重铬酸钾滴定法。由于中成药的组分多，制成的滴定用供试品溶液颜色深，严重干扰滴定终点颜色的判断，且各中药组分的重金属含量也会影响滴定的结果，因此含铁量不宜作为该制剂的定量指标；骨碎补的有效成分为柚皮苷，其水溶性差，且含量低，经过该制剂水提醇沉的工艺后该成分的损耗更大，在前期的薄层色谱鉴别研究中未能检出该成分，而用高效液相色谱法[1,16]预试验亦未能检出，因此，骨碎补中的主成分柚皮苷亦不宜作为该制剂的定量指标。鉴于以上情况，根据君臣佐使的原则，考虑选择葛根的有效成分葛根素来控制制剂的有效性。

3.2.2 提取方法及条件的选择 在样品提取条件及方法的研究中，按正交表L9(34)设计了正交试验，考察了四个因素：提取方法(超声、加热回流、振摇)、溶剂种类(50%甲醇、稀乙醇、30%乙醇)、溶剂量(40、50、60 mL)和提取时间(30、60、90 min)对提取效率的影响。结果表明，最佳提取条件为：以40 mL稀乙醇为提取溶剂，超声提取1 h。考虑到精密加入溶剂的准确性，选择溶剂量为50 mL，最终采用稀乙醇50 mL超声提取1小钟制备供试品溶液。

3.2.3 流动相的选择 参考相关文献[1,7-12]，选择对甲醇-水和乙腈-水两种流动相体系及比例进行了考察，发现甲醇-水(25∶75)和乙腈-水(11∶89)条件下，供试品中葛根素的出峰时间和分离效果都很好，均可满足检测要求。考虑溶剂的毒性与检测成本，本研究选择了甲醇-水(25∶75)为流动相。

3.2.4 检测波长的选择 葛根素为异黄酮类衍生物，有紫外吸收，可用HPLC-UV测定。以甲醇-水(25∶75)为流动相，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液5 μL进样，记录色谱图。葛根素对照品和供试品中葛根素色谱峰的二极管阵列检测器紫外吸收光谱图如图5所示。由图可知，葛根素的最大吸收波长为249 nm，参照现行版药典中相关葛根素含量测定方法，选择250 nm为测定波长。通过峰纯度分析，在250 nm波长下供试品溶液色谱图中葛根素色谱峰的峰纯度指数为1.00000，因此该波长作为检测波长，能满足含量测定的要求。

铁必康胶囊由9味药材制成，然而原标准中检验项目极为简单，项目设置非常不完善，无法真实客观评价铁必康胶囊产品的质量状况，更加无法有效地控制产品质量。本研究从质量标准的角度对铁必康胶囊的薄层色谱鉴别和含量测定方法进行了较为系统的研究，进一步完善了该制剂的质量评价方法，可更加科学、有效地评价该制剂的内在质量，保障临床用药的有效性。