非经典细胞焦亡体外模型的构建

石玉华，傅心雨，郑梦洁，吕 倩，师福山

(浙江大学动物科学学院，杭州 310058)

炎性小体主要是由模式识别受体、凋亡相关斑点样蛋白ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)、炎性Caspase(含半胱氨酸蛋白水解酶)组成的功能性多蛋白复合物[1-2]。炎性小体激活后，活化的Caspase激活切割pro-IL-1β和pro-IL-18转化为活性IL-1β和IL-18，并且切割全长gasdermin D(hGSDMD-FL)使其裂解为GSDMD-C端(GSDMD-p20)和GSDMD-N端片段(GSDMD-p30)，有活性的GSDMD-N端片段在细胞膜内侧打孔，形成10～20 nm孔径的膜孔，最终导致炎症细胞死亡，称为细胞焦亡[3-4]。细胞焦亡是一种全新的细胞死亡方式[5-6]，是由Gasdermin家族蛋白(主要是gasdermin D, GSDMD)介导的、以细胞膜形成孔洞、破裂以及细胞内容物大量释放为特征[7]。炎性Caspase，主要包括Caspase-1和Caspase-4/5/11，分别在经典和非经典炎性小体中发挥作用[8-9]。经典的细胞焦亡是由活化后的炎症性半胱氨酸氨酶-1(Caspase-1)切割GSDMD所介导，通过特异性切割GSDMD形成GSDMD-N端(GSDMD-p30)，导致细胞膜穿孔并同时促进LDH的释放，最终引起细胞焦亡[10]。非经典细胞焦亡是脂多糖(LPS)入侵至细胞胞质中，进而活化Caspase-4/5 (人)、Caspase-11 (鼠)，然后激活状态的Caspase-4/5/11直接裂解GSDMD为GSDMD-C端和GSDMD-N端片段，活性GSDMD-N端促进细胞产生焦亡现象[11]。非经典细胞焦亡与多种疾病的发生发展密切相关，进一步研究Gasdermin D介导的非经典细胞焦亡的调控机制将对疾病的预防治疗、新药物的研发提供理论依据。本研究成功构建了非经典细胞焦亡的体外模型，为后续其激活机制和药物研究提供可靠的模型。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、细胞株及菌株 pCMV-N-MYC、p3XFLAG-CMV-7.1和pcDNA3.1-MYC-C真核表达载体和人胚肾细胞HEK293T细胞株均由本实验室保存；Trans5α化学感受态细胞购自北京全式金生物技术 (TransGen Biotech) 有限公司。……