葛根芩连汤改善新型冠状病毒肺炎临床症状的网络药理学研究

夏 婷袁立霞田元新罗佳波梁 晓谭晓梅

（南方医科大学中医药学院，广东 广州510515）

2019年12 月，新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID⁃19）相继在中国和其他国家爆发，至2020年3 月2 日19 时，我国确诊人数80 175 人，死亡2 915 人，国外确诊人数达9 020 人，死亡人数136 人。COVID⁃19 初期的症状为干咳、乏力、反复发热，严重的可导致呼吸困难［1］等。在目前缺乏特效药的情况下，中药体现了极大的优势，中医将新冠肺炎归为“瘟疫”范畴，为正气不足，邪气入侵所致［2］。明代医家吴又可《温疫论》 曰：“温疫之为病，非风非寒非暑非湿，乃天地间别有一种异气所感”这里既写出了瘟疫的病因病机，也说明了瘟疫在辨证治疗上的特点，为感“毒”而发，所以治当排毒祛邪。肺肠同治，即是在“肺与大肠相表里”的理论指导下，对于新型冠状病毒感染的肺炎的治疗应考虑在疫毒邪盛时表里双解，宣肺透邪，通腑泄热。

葛根芩连汤出自《伤寒论》，为解表清里的代表方剂，由葛根、黄芩、黄连和甘草组成，有清热燥湿、解表清里之功［3］。方中重用葛根为君，葛根甘辛而凉，主入阳明经，外解肌表之邪，内清阳明之热，升发脾胃清阳而止泻升津；臣以黄芩、黄连清热燥湿，二药味苦性寒，性寒能清胃肠之热，味苦可燥肠胃之湿；甘草甘缓和中、清热解毒、止咳祛痰为佐使药［4⁃7］。四药合用，外疏内清，表里同治，根据其功能主治与组方配伍理论适用于新型冠状病毒感染肺炎之表邪未解，里热炽盛之证。由葛根芩连汤开发的制剂葛根芩连丸为药典收载品种，为卫生部《传染性非典型肺炎（severe acute respiratory syndrome，SARS）诊疗方案》（2003年）和卫生部《人禽流感诊疗方案（2005 版）》 及卫生部《甲型H1N1 流感诊疗方案（2009年试行版第一版）》 推荐用药。课题组前期研究证实葛根芩连汤具有抗多种病毒的作用［8⁃9］，还有抗炎、止咳、解热作用［10］，由此提示葛根芩连汤可用于新型冠状病毒感染肺炎的治疗。

网络药理学是生物学、药理学和信息学等多学科结合的一门科学，强调对信号通路、多成分⁃多靶点进行分析研究［11］。本研究通过网络药理学阐明葛根芩连汤治疗新冠肺炎引起的干咳、发热和呼吸困难的活性成分、靶标、作用机制，以期为COVID⁃19 的用药提供新思路。

1 方法

1.1 葛根芩连汤复方成分搜索 借助中药系统药理学分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP）（http：／ ／tcmspw.com／tcmsp.php）分别以葛根、黄芩、黄连和甘草作为搜索关键词，得到葛根芩连汤的化学成分。

1.2 复方活性化合物及靶标蛋白的筛选 口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）是药物吸收、分布、代谢、排泄最重要的药动学参数之一，它表示口服药物的有效成分或活性基被吸收到达体循环并吸收的速度与程度，OB值越高通常表示药物的生物活性越好和类药性（Drug⁃likeness，DL）越好。借助TCMSP 数据平台，筛选出葛根、黄芩、黄连、甘草所含化合物中符合OB≥30%且DL≥0.18 的化学成分作为活性成分，并得到相关靶标蛋白。

1.3 COVID⁃19 引起的干咳、发热、呼吸困难靶点筛选 在Drug Bank（https：／ ／www.drugbank.ca／）数据库中输入“dry cough”“tussiculation”“pyrexia”“dyspnea”为关键词获得干咳、发热、呼吸困难的靶点。将上述成分靶点与疾病相关靶点取交集，分别获得葛根芩连汤治疗干咳、发热和呼吸困难的作用靶点，进行后续分析。

1.4 靶标蛋白基因名的确定及药材⁃化合物⁃靶标网络的构建 借助Uniprot（https：／ ／www.uniprot.org／）数据库查询靶标蛋白对应的基因名和ID号，并用Cytoscape 3.7.2软件构建化合物⁃靶标网络，分析化合物和靶点网络。

1.5 靶点的通路分析 为了进一步了解上述筛选出的靶标蛋白基因的功能以及在信号通路中的作用，将筛选得到的葛根芩连汤作用的靶点导入DAVID 数据库（https：／ ／david.ncifcrf.gov／），通过输入靶基因名称列表并限定物种为人，将所有靶基因名称校正为其官方名称（official gene symbol），经上述数据库检索和转化操作，设定阈值P＜0.05，进行GO 生物学过程富集分析和KEGG 信号通路富集分析，并将结果可视化。

1.6 主要活性成分⁃目标分子对接 将化合物⁃靶标网络分析中度值大，且蛋白结构为“人”的靶点ADRB2 与上述互作关系成分进行分子对接。通过ChemBioDraw 软件绘制分子结构后，导入软件Sybyl⁃X 1.1 进行三维结构转换、加氢处理及Minimize 能量优化，结果保存为mol2 文件格式。从PDB 数据库（https：／ ／www.rcsb.org／）下载ADRB2 的3D 结构（*PDB 格式，ID 为3D4S），去除水分子、加氢和除侧链的残基后，采用Sybyl⁃X 1.1 对接软件的Surflex⁃Dock 程序与核心化合物进行对接并打分，以ligand 作为对照，参数均为默认参数。Surflex⁃Dock 打分函数是以log（KD）为单位表示结合作用力，打分越高，说明配体与受体结合越稳定。

2 结果

2.1 活性化合物的搜索 通过TCMSP 数据库检索到葛根、黄芩、黄连和甘草中化合物，其中葛根18个、黄芩58个、黄连33个、甘草280个，以OB≥30%且DL≥0.18 为筛选条件，得到133个活性化合物，其中葛根5个、黄芩26个、黄连10个、甘草92个。通过化合物⁃靶点相互作用网络，葛根芩连汤中网络节点较大的部分活性化合物见表1。

表1 葛根芩连汤部分活性化合物基本信息

2.2 化合物⁃靶点相互作用网络 在葛根芩连汤⁃干咳的化合物⁃靶点网络中，复方中17个化合物对应76个靶点，红色圆点表示中心度值较大的活性化合物和靶点，主要包括甘草成分MOL004810⁃粗毛甘草素F、MOL000500⁃维斯托尔、MOL005007⁃糖精蛋白M，黄芩成分MOL002927⁃黄芩黄酮Ⅱ、MOL002911⁃2，6，2’，4’ ⁃四羟基⁃6’ ⁃甲氧基查耳酮；主要靶点包括SCN5A、ACHE、ADRA1B、CHRM1、SLC6A4 等。葛根芩连汤⁃发热的化合物⁃靶点网络中，包含18个化合物及65个相应靶点，中心度值较大的化合物主要包括葛根成分MOL001999⁃滨蒿内酯、MOL000392⁃芒柄花黄素，黄芩成分MOL002917⁃5，2，6⁃三羟基⁃6，7 甲氧基黄酮，关键靶点为ADRA1B、ADRB2、PTGS1、PTGS2、PPARG 等；葛根芩连汤⁃呼吸困难的化合物⁃靶点网络中，包含20个化合物及45个相应靶点，中心度值较大的化合物包括甘草成分 MOL002311⁃甘草酚，黄芩成分MOL002927⁃黄芩黄酮Ⅱ，关键靶点为ADRA1A、ADRA1B、ADRB2、MAOB 等。见图1。

图1 葛根芩连汤化合物⁃靶点网络

2.3 靶点通路可视化 通过数据库DAVID 进行的GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析。GO 富集分析包括生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和细胞组分（cellular component，CC）3个分支，对干咳有关的靶点进行分析，设定阈值P＜0.05，共富集到GO 条目77 条，其中生物过程（BP）条目45个，细胞组成（CC）条目17个，分子功能（MF）条目15个，分别占58.4%、22.1%、19.5%，KEGG 通路富集筛选得到8 条信号通路，涉及神经活性配体⁃受体相互作用通路、钙信号通路、胆碱能突触通路等，均涉及OPRM1、CHRM4、CHRM3、CHRM2、CHRM1、ADRA1B、ADRA1A、CHRNA7、ADRA1D、CHRNA2 等靶点，见图2。

图2 葛根芩连汤缓解干咳症状化合物靶点GO 功能分析、KEGG 通路分析

与发热相关靶点中，设定P＜0.05，共富集到GO 条目93个，其中生物过程（BP）条目67个，细胞组成（CC）条目8个，分子功能（MF）条目18个，分别占72.0%、8.6%、19.4%，KEGG 通路富集筛选得到19 条信号通路，涉及心肌细胞肾上腺素信号转导通路、钙信号通路、神经活性配体⁃受体相互作用通路，均涉及ADRB2、ADRA1B、ADRA1A、ADRA1D 等靶点，见图3。

图3 葛根芩连汤缓解发热症状化合物靶点GO 功能分析、KEGG 通路分析

涉及呼吸困难的靶点中，富集得到GO 条目18个（P＜0.05），其中生物过程（BP）条目12个，细胞组成（CC）条目4个，分子功能（MF）条目2个，分别占66.7%、22.2%、11.1%，KEGG 通路富集筛选得到7 条信号通路，涉及心肌细胞肾上腺素信号通路、cGMP⁃PKG 信号通路、钙信号通 路，均涉及 ADRB2、ADRA1B、ADRA1A、ADRA1D 等靶点，见图4。

图4 葛根芩连汤缓解呼吸困难化合物靶点GO 功能分析、KEGG 通路分析

2.4 分子对接结果 将处理好的活性化合物与ADRB2 对接，对应的化合物作为配体，Surflex⁃Dock 程序打分＞5.0的认为化合物与靶点蛋白具有较强的亲合力。结果表明，ADRB2 与化合物5，2，6⁃三羟基⁃6，7 甲氧基黄酮、黄芩黄酮Ⅱ、维斯托尔具有较好的亲合力，分子对接模式见图5，各化合物得打分结果见表2。

图5 ADRB2 与互作关系成分分子对接模型图

表2 ADRB2 与其对应的小分子化合物的对接得分

3 讨论

新型冠状病毒肺炎COVID⁃19 属于中医学疫病范畴，正气不足，邪气入侵为其主要致病因素，化热入里为重要病机转归。目前对COVID⁃19 的中医分析，该病早期病因为“湿毒疫”，病位在中焦［12］，表现为干咳、反复发热、呼吸困难，葛根芩连汤外疏内清、解肌透表、清热解毒、可用于表邪入里引起的乏力、发热、干咳等；现代药理学研究结果显示方中葛根具有退热作用，可用于治疗发热头疼［13］；黄芩具有消炎、抗氧化、抗病毒作用，在全国各省区中医药治疗新型冠状病毒肺炎（COVID⁃19）的诊疗方案中，黄芩为治疗COVID⁃19 早期咳嗽、发热的高频药物之一［14］；黄连可通过作用肠道菌群调节机体免疫力而改善机体症状［15⁃16］；甘草具有免疫调节、化痰止咳作用［17］。四味药组方可改善新型冠状肺炎引起的发热、干咳、呼吸困难、腹泻等临床症状。首例新型冠状病毒肺炎死亡的尸检报告显示，患者死亡多由肺内痰栓导致缺氧而死［18］，提示该方可以对于COVID⁃19 咳嗽和痰栓起到止咳化痰作用。

网络药理学研究显示，葛根芩连汤对干咳、发热和呼吸困难均有治疗作用，网络表明方中治疗干咳的主要药物为甘草、黄芩，甘草、黄芩祛痰止咳、清肺热，可用于COVID⁃19 的治疗。葛根芩连汤改善COVID⁃19 引发的干咳，可能通过调节 SCN5A、ACHE、ADRA1B、CHRM1、SLC6A4 等靶点作用于神经活性配体⁃受体相互作用通路、钙信号通路、胆碱能突触通路；复方中治疗发热的主要药物为葛根、黄芩，葛根、黄芩均是解肌退热的常用药物，可能通过调节ADRA1B、ADRB2、PTGS1、PTGS2、PPARG等靶点作用于心肌细胞肾上腺素信号转导通路、钙信号通路、神经活性配体⁃受体相互作用通路，达到退热的效果；网络显示复方中缓解呼吸困难症状的药物主要为黄芩、甘草，黄芩、甘草可能通过改善肺部功能从而改善呼吸困难症状，但以上作用机制需进一步研究。

分子对接结果表明，核心化合物主要通过氢键，π⁃π共轭及范德华力相互作用与ADRB2，即β2肾上素腺能受体结合，调节心肌细胞肾上腺素信号转导通路、胆碱能突触通路等改善COVID⁃19 引发的干咳、发热和呼吸困难等症状。研究表明黄芩素、芒柄花素、汉黄芩素、小檗碱、黄连碱等可用于治疗新型冠状病毒肺炎［19⁃21］，且以上成分均为葛根芩连汤主要活性成分，以期为葛根芩连汤改善新型冠状病毒肺炎临床症状提供理论依据。

在目前还未有针对新型冠状病毒肺炎特效药的形势下，中医药多成分，多靶点相互作用的治疗特点取得了低死亡率、高治愈率的显著成果。应理性科学开展新冠肺炎中药临床研究，对于有效药物，可考虑先治疗，再评估［22］。葛根芩连汤作为古代经典名方之一，有丰富的临床用药经验及用药历史，安全性和有效性得到充分肯定，无明显不良反应，可用于轻型和普通型患者的治疗；且葛根芩连复方目前已有中成药出售，大大提高了药物供给效率。

综上所述，通过网络药理学方法对葛根芩连汤治疗COVID⁃19 引起的干咳、发热及呼吸困难的活性成分、靶点及通路进行分析研究，葛根芩连汤通过多成分、多靶点、多通路协同作用来发挥疗效。介于网络药理学研究的局限性，后期可对活性成分⁃靶点⁃通路进行实验验证研究，以期为葛根芩连汤治疗COVID⁃19 提供依据。