磷脂酰肌醇蛋白聚糖1在胰腺导管腺癌组织中的表达及临床意义

李欢 李扬 杜娟 郭丽梅

1北京大学第三医院病理科，北京 100191；2北京大学医学部基础医学院病理学系，北京 100191

PDAC是全球第七大癌症相关死亡原因[1]，预计到2030年将成为癌症死亡的第二大原因[2]。PDAC手术切除率低，对放化疗敏感度差，大多数靶向治疗的临床效果不满意。因此，需要寻找潜在的分子标志物来帮助PDAC的早期诊断和靶向治疗。磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(glypican1，GPC1)在前列腺癌[3]、肝癌[4]、食管癌[5]及胶质母细胞瘤[6]等肿瘤组织中异常表达，并与肿瘤的发生发展有关。研究报道GPC1阳性的循环外泌体可以区分PDAC和胰腺良性疾病患者，特异性和敏感性接近100%[7]。本研究检测PDAC组织GPC1的表达，分析其与临床病理特征及患者预后的相关性，探讨GPC1对PDAC临床诊断及治疗的价值。

材料与方法

一、胰腺组织标本

收集2015年1月至2018年12月间北京大学第三医院病理科存档的125例PDAC组织石蜡标本和对应的癌旁正常胰腺组织标本。纳入标准：(1)术前未接受新辅助化疗、放疗等其他抗肿瘤治疗；(2)术中证实无远处转移，接受标准的胰腺癌根治术；(3)术后病理资料证实所有切缘为R0或R1切除(R0切除为肉眼和显微镜下均未看到肿瘤残留；R1切除为肉眼未看到肿瘤残留，但在显微镜下能看到肿瘤残留)；(4)患者临床及随访资料完整。本研究经北京大学第三医院医学科学研究伦理委员会审查并批准通过(IRB00006761-M2021030)。

二、GPC1蛋白表达检测及分组

标本常规切片，厚度为4 μm，采用免疫组织化学Envision二步法检测所有标本GPC1蛋白表达，严格按试剂盒说明书操作。兔多克隆GPC1抗体(ab73979)购于英国Abcam公司，工作浓度1∶200。以磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照，以胞质颗粒状染色和(或)胞膜染色判读为GPC1蛋白阳性表达。由两位病理医师进行独立评估，根据染色强度和阳性细胞百分比进行评分[5]：阴性或阳性细胞占比<15%为0分；染色呈淡黄色占比>50%，或染色呈黄色占比15%～50%为1分；染色呈黄色、阳性细胞占比>50%，或 染色呈棕黄色、占比15%～50%为2分；染色呈棕黄色、占比>50%为3分。0和1分为低表达组，2和3分为高表达组。

三、随访

通过患者术后就诊记录及电话方式进行随访。就诊记录包括门诊复查记录、急诊就诊记录和再次入院记录。随访截止至2020年12月31日。患者总生存期定义为手术日期至死亡时间或末次随访时间(月)。

四、统计学处理

采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。计数资料以例(%)表示，组间比较采用χ2检验。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，生存期差异比较采用Log-rank检验。采用单因素及多因素Cox回归模型分析评估影响患者生存期的危险因素，以风险比(hazard ratio，HR)及95%置信区间(95%CI)表示。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、PDAC组织与正常胰腺组织GPC1蛋白表达

免疫组织化学染色示肿瘤细胞的胞质内呈细颗粒状阳性着色和(或)胞膜阳性表达，而癌旁正常胰腺组织均为阴性表达(图1)。PDAC组织GPC1蛋白阳性表达率显著高于癌旁正常胰腺组织，差异有统计学意义(χ2=93.407，P=0.000)。125例PDAC组织中38例(30.4%)GPC1蛋白表达评分为0分，19例(15.2%)为1分，23例(18.4%)为2分，45例(36.0%)为3分，高表达率为54.4%(68/125)。

注：GPC1为磷脂酰肌醇蛋白聚糖1图1 胰腺导管腺癌肿瘤细胞胞质(1A)、胞膜(1B)及侵犯神经的肿瘤细胞(1C)GPC1阳性表达(免疫组织化学 ×200 ×400)

二、GPC1蛋白表达与PDAC临床病理特征的相关性

PDAC组织GPC1蛋白高表达与肿瘤部位和T分期均显著相关，而与患者性别、年龄、有无糖尿病和胰腺炎病史、血CA19-9水平、切缘情况、肿瘤分化程度、淋巴结转移、神经侵犯及脉管侵犯均无相关性(表1)。

表1 胰腺导管腺癌组织GPC1蛋白表达与临床病理特征的相关性[例(%)]

三、GPC1蛋白表达与PDAC患者总生存期的关系

Kaplan-Meier法生存分析显示，PDAC组织GPC1阳性表达与患者预后呈负相关，GPC1蛋白高表达组及低表达组的中位生存期分别为(11.00±0.82)个月(95%CI9.387～12.613)、(18.00±2.36)个月(95%CI13.382～22.618)，高表达组显著低于低表达组，差异有统计学意义(P<0.01，图2)。单因素Cox比例风险分析显示，T分期和GPC1蛋白阳性表达是影响PDAC患者术后总生存期的危险因素(P<0.001，表2)。多因素Cox比例风险分析显示，T分期和GPC1蛋白表达水平是影响PDAC患者总生存期的独立危险因素(P<0.001，表2)。

表2 125例胰腺导管腺癌患者术后总生存期的单因素及多因素分析

注：GPC1为磷脂酰肌醇蛋白聚糖1

讨 论

近年来，应用患者液体活检材料，结合外泌体、循环肿瘤细胞和代谢小分子化合物检测以寻找PDAC早期诊断标志物的研究取得了可喜进展[7-9]。血清中GPC1阳性的循环外泌体结合CA19-9检测能够发现82%的早期PDAC，并能够在术后随诊和患者预后预测方面发挥作用，受到广泛的关注[10]。本研究结果显示，PDAC组织中GPC1蛋白表达升高且GPC1蛋白表达与肿瘤T分期呈正相关。PDAC的T分期标准依赖于肿瘤大小(T1～T3)和累及腹腔干、肠系膜上动脉和(或)肝总动脉(T4)的情况[11-12]，提示GPC1可能参与PDAC的发生与进展，GPC1高表达的肿瘤生长更为活跃，侵袭能力更强。此外，GPC1蛋白高表达与患者的总生存期呈负相关，是患者不良预后的独立危险因素，与Lu等[13]的研究结果一致。

GPC1由核心蛋白及糖链构成，具有胞内段和跨膜段结构域。GPC1的功能受到其糖链硫酸化程度以及核心蛋白锚着位点结构的影响[14]。本研究结果显示GPC1在PDAC肿瘤细胞胞质和胞膜均呈阳性表达，此染色模式可能提示GPC1蛋白处于不同的结构、剪切状态和功能阶段。在PDAC发生和进展的过程中，GPC1可能保持了持续的蛋白合成与分泌，并在以近胞膜的区域发挥功能。

PDAC的原发位置(头部与体尾部)与临床预后之间的关系尚有争议。Birnbaum等[15]研究比较了208例胰头部和41例体尾部样本的临床病理学和基因表达数据，表明PDAC解剖学位置是一个独立的预后因素。头部原发PDAC患者的2年总生存率高于体尾部PDAC，并分析鉴定出334个差异表达基因。头部组上调的基因提示细胞毒性T淋巴细胞、髓源性巨噬细胞等免疫细胞活化和胰腺外分泌功能活跃；体尾部组的免疫原性特征表达显著降低，并且上调基因与肿瘤细胞的鳞状分化有关。另有研究报道，与胰头PDAC相比，体尾部PDAC的K-ras和Smad4表现出更丰富的基因学改变[16-17]，提示发生在胰头钩突部的PDAC与发生在胰体尾部的PDAC在驱动性分子事件、肿瘤免疫环境和癌细胞表型上可能存在本质差异。导管上皮可能在不同的微环境、不同的驱动突变下出现不同的分化和演进行为。本研究显示GPC1表达与肿瘤部位相关，胰头钩突部GPC1高表达率为60.6%，体尾部为35.5%，推测这种表达差异可能由上述诸多原因导致。未来需要结合更多病例及详细的分子检测数据综合分析加以明确。

本组伴有神经侵犯的72例PDAC中，41例GPC1高表达，占56.9%(41/72)。尽管统计学分析GPC1高表达与神经侵犯无相关性，但在上述41例PDAC中能够观察到多根神经纤维周围肿瘤细胞的GPC1呈阳性表达。PDAC的肿瘤微环境具有促结缔组织增生和高度神经支配的现象，神经周围浸润是PDAC的一个典型组织学特征。在这个过程中肿瘤细胞沿着固有的神经纤维生长和迁移，并与不良预后相关[18-19]。PDAC主要起源于胰腺外分泌部的导管上皮，其接受大量感觉和肾上腺素能神经支配。与均匀分布于整个胰腺的肾上腺素能神经支配不同，感觉神经支配在胰腺头部的外分泌部最丰富，而胰头是多数PDAC的原发部位。在转基因小鼠PDAC模型中，使用化学方法去除感觉神经后发现，感觉神经缺失可减少癌前病变——胰腺导管上皮内瘤变的发生，并抑制癌前病变向PDAC的进展[18-19]。有大量研究发现，GPC1作为一种细胞表面的糖蛋白，能够与多种生长因子和细胞因子结合，这种相互作用对血管生成和肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移能力产生持续影响[15,20]。在PDAC中，GPC1与神经生长因子是否存在相互作用需要进一步探讨。

综上所述，GPC1蛋白在PDAC肿瘤细胞中异常高表达，GPC1蛋白高表达与肿瘤T分期及患者总生存期呈显著相关性，是患者不良预后的独立危险因素。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突