分光光度计法检测鸡蛋蛋黄颜色的研究

宋汉良，熊爱军，邢宏博，许赣荣,，倪冬姣,，邹新华,*

(1.播恩集团股份有限公司，江西 赣州 341000；2.佛山播恩生物科技有限公司，广东 佛山 528100)

鸡蛋是受大众欢迎的营养食品之一[1]，鸡蛋蛋黄的颜色一直为人们重视。在我国，人们一般认为蛋黄颜色金黄、色泽较深的鸡蛋品质良好，深黄色的蛋黄对人的食欲有明显的刺激作用，深受人们喜爱；而蛋黄色泽较浅的鸡蛋则不受人喜爱[2-4]。因此蛋黄颜色的深浅可作为判断鸡蛋品质的感官指标和质量指标[5]。

目前，国际上对蛋黄颜色的评价方法主要有：罗氏扇形卡法[6]、蛋黄颜色视觉指数法[7-8]、Herman-Carver色转法(蛋黄颜色打分仪器)[9]、NEPA法、Fletcher环法和色差仪测色[10]等。上述方法各有优缺点，应根据具体要求加以选择。

罗氏扇形卡是目前较为通用的测定蛋黄颜色的工具。在比色扇上的“蛋黄带”选择15个色级(旧法是12级)，覆盖从淡黄到橙红的全部范围，且每一级都易被肉眼区分。罗氏扇形卡法的主要缺点是要通过人工的感官判断给蛋黄颜色打分，不同人的感官判断有所不同，故出现人为误差的可能性较大。

我们研究了一种可用于蛋黄颜色定量检测的分光光度计法，即用特定的溶剂对蛋黄进行萃取，在特定的检测波长下，检测萃取液的光密度(Optical Density，OD)值，根据OD值及稀释倍数的大小，计算蛋黄萃取液的色度值，从而实现对蛋黄颜色深浅表达的数值化，杜绝人为判断带来的误差，提高客观评价蛋黄颜色深浅的可靠性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鸡蛋：购自超市或公司自产；编号为 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10组，各若干枚。

乙醇、乙酸乙酯、丙酮、石油醚、甲醇均为分析提纯(西陇化工股份有限公司)。

培养皿：TGL-16M 高速冷冻离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；UV1600紫外可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)；QL-866 涡旋仪(上海书培实验设备有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 分光光度计法

● 萃取溶剂的选择

精准称量1 g生蛋黄(或熟蛋黄)于离心管中，分别加入5 mL不同萃取剂(水、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、石油醚和甲醇)，充分混匀后置于高速冷冻离心机中，温度设置为4 ℃，以6 000 r/min的速度离心10 min，重复萃取4次。观察残渣颜色变化，4次萃取后，蛋黄残渣显示白色，说明其中的色素全部被萃取到溶剂中。

● 特征波长的测试及选择

精准称量1 g生蛋黄(或熟蛋黄)于离心管中，加入适量萃取剂，混匀，充分提取蛋黄色素，然后置于高速冷冻离心机中，温度设置为4 ℃，以6 000 r/min的速度离心10 min；取上清液，于分光光度计进行全波长扫描。所有试验平行测定3次。

分光光度计法所得某一特征波长下鸡蛋蛋黄色度值的计算公式为：

C＝A×n

式中：C为蛋黄色度值；A为特征波长下的吸光度值；n为释倍数。

● 蛋黄颜色色度值检测：

准确称量1 g蛋黄于10 mL离心管，加入5 mL萃取试剂，充分混匀萃取，置于高速冷冻离心机中，温度设置为4 ℃，以6 000 r/min的速度离心10 min，分3次萃取，合并上清液，于分光光度计进行比色，检测特征波长，记录数据。根据公式计算蛋黄色度值。

1.2.2 罗氏扇形卡法

● 生蛋黄的比色

每组取一枚鸡蛋，破蛋壳，将蛋黄分离出来放于另一个新的干净、贴有编号的培养皿或白色瓷碟中，蛋清弃用(收集至烧杯或大碗中)，蛋壳弃用(入垃圾桶)。

由3个人用罗氏扇形卡对每个生蛋黄颜色进行比色，读出最接近相应色卡颜色的数字。记录每个生蛋黄的比色值，计算平均值。

● 熟蛋黄的比色

锅中盛适量水，烧开。将生蛋黄转移至可以加热的平底菜盘或小碗(每枚蛋黄的盘旁或碗边需有鸡蛋编号)，盖保鲜膜，放入蒸笼后开始计时，蒸5 min。将蛋黄从蒸笼上取出，去保鲜膜后开始计时，冷却3 min～5 min。将熟蛋黄从中间平切开来。由3个人用罗氏扇形卡对每一枚熟蛋黄颜色进行比色，读出最接近相应色卡颜色的数字。记录每个熟蛋黄的比色值，计算平均值。

1.3 数据处理与分析

数据统计分析均采用SPSS 22.0软件对数据进行方差分析，利用Duncan式多重比较对差异显著性进行分析(P＜0.05表示差异显著；P＜0.01表示差异极显著)，用Origin软件作图。

2 结果与分析

2.1 分光光度计法中蛋黄色素萃取溶剂的选择

衡量鸡蛋质量的最直观的判定标准之一是蛋黄的颜色[1]。鸡蛋蛋黄的颜色主要来源于鸡日粮中具有着色功能的各类色素，如叶黄素[11-12]之类的天然类胡萝卜素[13]、斑蝥黄[14]。本文采用多种萃取剂(水、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、石油醚和甲醇)对蛋黄中的色素进行萃取。从表1可以看出，随萃取次数增加，蛋黄残渣颜色变浅。其中，以丙酮为蛋黄色素萃取剂的试验组，经过一次萃取之后，剩余蛋黄残渣的颜色明显浅于其他萃取剂(图1的4～6号)，说明以丙酮作为蛋黄色素萃取剂，色素萃取更完全，其萃取色素的效果优于其他萃取剂。故后续试验均选用丙酮为蛋黄色素萃取剂。

图1 不同萃取剂对蛋黄色素的萃取效果

2.2 分光光度计法特征性检测波长的选择

目前在各种色素检测波长的研究中，黄色素一般用380 nm～420 nm波长检测，而橙色素和红色素主要用468 nm～505 nm波长检测[15-20]。对同一鸡蛋蛋黄用不同萃取剂萃取，将所得的萃取液进行全波长扫描，结果发现所有萃取液都在425 nm、450 nm和475 nm出现OD峰值，有关结果如图2所示。从图中还可看到，采用丙酮萃取的蛋黄萃取液在425 nm、450 nm和475 nm的吸收峰值均显著高于其他萃取剂(P＜0.05)。此外，在不同鸡蛋蛋黄的丙酮萃取液全波长扫描图(图3，其中仅列出3种不同的鸡蛋)中，发现不同鸡蛋蛋黄萃取液在425 nm、450 nm和475 nm波长下均出现同样的吸收峰值。这说明425 nm、450 nm和475 nm波长是试验中所有鸡蛋蛋黄萃取液在分光光度计图谱上的特征波长，且主要在黄色素与橙色素检测波长范围内，与肉眼所看的蛋黄颜色相对应，故选用425 nm、450 nm和475 nm作为分光光度计法检测蛋黄颜色的测定波长是可靠的。

2.3 分光光度计法与罗氏扇形卡法的比较

罗氏扇形卡法主要是肉眼观察，用比色卡人为判断蛋黄颜色深浅，根据相近色号比色卡的数值来对蛋黄颜色进行打分。由图4和图5可以看出，第3、4和5组鸡蛋生蛋黄的色度值相近，这对人为判断会造成一定的干扰，不易区分。此外，随着样品暴露在空气中的时间延长，蛋黄颜色的变化也会对人为判断造成干扰。分光光度计法只需称取适量的蛋黄，加入适量的萃取剂，用得到的萃取液进行比色。如图6所示，用分光光度计法评估第3、4和5组鸡蛋生蛋黄的颜色，蛋黄颜色由深到浅依次是第4组、第5组和第3组。总体上，从罗氏扇形卡法与分光光度计法检测所得各组鸡蛋蛋黄色度值数据来看，两种方法对各组鸡蛋蛋黄颜色的深浅判断结果相似。分光光度计法可以将蛋黄颜色深浅表达为数值，通过判断数值大小，可以更加容易区分不同组蛋黄颜色的深浅，而且不需要人为感官评估，因此分光光度计法的检测结果更加客观、公正、可靠。

图4 第3、4和5组鸡蛋蛋黄样品

此外，对10组鸡蛋的生蛋黄进行两种检测方法的比较，用分光光度计法在波长为425 nm、450 nm、475 nm检测生蛋黄OD值(三个平行样的平均值)，用罗氏扇形卡法得到同样10组鸡蛋蛋黄的色度值，结果按颜色深浅排序，如表2所示。结果表明，两种方法得到的蛋黄颜色检测结果排序趋于相同。

3 结论

在本研究中，采用罗氏扇形卡法评估蛋黄颜色深浅时，会出现许多干扰因素，如不同人的感官判断误差较大(图4)；其次，随着样品在空气中的暴露时间延长，蛋黄表面水分散失，导致人为判断误差增大；再次，不同来源蛋黄颜色相近造成的判断误差等，最终都会导致结果评估不准确。本文建立的分光光度计法，在操作过程中能够杜绝人为判断等干扰因素造成的误差，并且将蛋黄颜色深浅数值化，使评估结果更加客观公正，也更加容易区分不同鸡蛋蛋黄颜色深浅。该方法简单，操作步骤精简，所用仪器是实验室常用的分光光度计，便于推广。