罗汉果多糖的羧甲基化修饰及抗氧化性能影响研究

白家峰，姚延超，郑 毅，刘绍华，刘启斌，周 奕，邢雨晴，杨雯静，许春平

（1.广西中烟工业有限责任公司技术中心，南宁 530001；2.郑州轻工业大学食品与生物工程学院，郑州 450002；3.广西真龙实业有限责任公司技术中心，广西 贺州 542600）

罗汉果（Siraitia grosvenorii）是中国特有的多年生葫芦科攀援植物，含有丰富的维生素C、葡萄糖等人体所需功能成分，被卫生部认证为药食两用的中药材，有止咳、润喉的作用，又被誉为“神仙果”［1］。目前对罗汉果多糖的研究主要集中在抗氧化、降血糖、抗肿瘤活性以及药理方面的研究［2-7］，但是对罗汉果多糖进行羧甲基化修饰以及羧甲基化产物的抗氧化性能的研究较少。

自由基是一类非常活跃的化学物质，是带有不成对（奇数）电子的原子、原子团、分子和离子。人体内自由基的增多会导致免疫功能出现障碍，长时间可引发炎症并加剧衰老［8］。Chen等［9］采用热水浸提法制备苦瓜多糖，并制备羧甲基化苦瓜多糖（CMP），通过对苦瓜多糖和羧甲基化苦瓜多糖的抗氧化性测试，证明羧甲基化修饰能明显地提高苦瓜多糖的抗氧化性。赵鹏等［10］通过响应面分析法优化了羧甲基化倒卵叶五加多糖的合成工艺，优化工艺后得到的羧甲基化倒卵叶五加多糖相比于倒卵叶五加多糖抗氧化活性有了明显地改善。

本研究选取广西的罗汉果为研究对象，通过酶解法提取罗汉果多糖，并对提取的罗汉果多糖进行羧甲基化修饰，同时研究其清除自由基的能力，为今后罗汉果多糖在保健食品中的应用与开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试剂、材料与仪器

材料：罗汉果（产自广西）。

试剂：乙酸乙酯、氢氧化钠、甲醇、水杨酸、冰乙酸、正丁醇、异丙醇、丙二醇吡啶、氯仿、三氟乙酸、纤维素酶、果胶酶、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、30%过氧化氢均为国产分析纯。

主要仪器：SCIENTZ-10N冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司；DGX-9143电热恒温鼓风干燥箱，上海福玛实验设备有限公司；永磁直流电动搅拌器，上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司；Nicolet5700型傅里叶变换红外光谱仪，Fourier transformInfrared spectrometer FTIR，美国布鲁克海文仪器公司；UV-17001C紫外分光光度计，上海凤凰光学科仪有限公司。

1.2 方法

1.2.1 罗汉果多糖的提取 使用酶解法提取罗汉果多糖［11］。将罗汉果干燥并粉碎，乙酸乙酯加热回流脱脂2 h。烘干后称取脱脂罗汉果粗粉200 g，加入4 000 mL质量分数为0.9%的氯化钠溶液浸提3 h。静置后，收集沉淀。加入4 000 mL质量分数为0.1%纤维素酶和0.25%果胶酶的水溶液浸提12 h，离心（4 000 r/min，15 min），收集上清液，加入Sevage试剂（V氯仿∶V正丁醇=4∶1）脱蛋白［12，13］，搅拌0.5 h，离心后收集上清液，重复操作3次。分离出上清液，使用过氧化氢除去色素。将所得上清液在60℃下旋转蒸发，浓缩后加入3倍上清液体积的无水乙醇，沉降2 h，离心取沉淀，加水至溶解。将所得溶液进行浓缩，冷冻干燥得到精制罗汉果多糖。

1.2.2 羧甲基化修饰 使用李霞等［14］的方法并加以改进，取罗汉果多糖200 mg，溶于25 mL异丙醇，搅拌下加入20%氢氧化钠10 mL碱化处理3 h。将2.63 g氯乙酸溶于25 mL的异丙醇，再加入20%氢氧化钠溶液10 mL，充分搅拌，缓慢滴加一半混合液于反应液中，搅拌3 h。升温至60℃反应30 min。滴加另一半混合液于反应液中，在60℃下反应1 h。用0.5 mol/L CH3COOH溶液调节反应液至pH 7。透析5 d，浓缩至10 mL，冷冻干燥得到羧甲基化的罗汉果多糖。

1.2.3 羧甲基化取代度的测定 精确称取10 mg羧甲基化罗汉果多糖样品，放入烘箱中干燥1～2 h，加入体积分数为70%的乙醇3 mL，混合后放置5 min。依次加入10 mL蒸馏水，50 mL 0.5 mol/L的NaOH溶液，混合搅拌至多糖样品溶解。然后用0.1 mol/L的HCl滴定，以酚酞为指示剂，至红色褪去，计算每克羧甲基多糖所需HCl的用量A［15］。

式中，V0代表加入的NaOH的体积，mL；V2代表测定消耗的HCl的体积，mL；V1代表空白测定所消耗HCl的体积；M0代表加入的NaOH浓度；M代表HCl的浓度；W为样品的质量，g。羧甲基取代度（DS）计算公式如下。

1.2.4 单糖组成分析 称取20 mg罗汉果多糖，溶于15 mL 2 mol/L的三氟乙酸，121℃油浴水解。将所得溶液旋干，然后加入2 mL甲醇，再次蒸干，重复3次。加入2 mL吡啶，0.2 mL衍生试剂BSTFA∶TMCS（99∶1），80℃加热4 h。过0.45 mm滤膜，利用GC-MS法检测各单糖成分。

色谱条件：HP-5MS型弹性石英毛细管柱（30.0 m×250μm×0.25μm）；载气氦气；流速1 mL/min，溶剂延迟10 min；进样方式为分流比5∶1；进样口温度250℃，进样量1μL。程序升温为初始温度50℃，保持2 min，然后以4℃/min的速率升至240℃，并保持5 min。

质谱条件：EI源，电子能量70 eV，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，质量扫描范围30～550 AMU，传输线温度240℃，对采集到的质谱图用NIST11谱库进行检索。比较标准单糖与样品保留时间，确定单糖组成。

1.2.5 红外光谱分析 称取2～3 mg精制罗汉果多糖和羧甲基化罗汉果多糖，加入KBr粉末，磨细之后压片，使用傅立叶变换红外光谱仪，在4 000～400cm-1内扫描红外吸收值。

1.2.6 SEC/MALLS/RI分析 体积色谱（SEC）—示差检测（RI）—多角度激光光散射（MALLS）联用技术兼具了色谱法和光散射法的特点，光散射仪可从多个不同角度对散射光进行检测，同时能快速、准确地测定出高分子的重均分子量（Mw）、数均分子量（Mn）、粘分子量、分子量分布等，而且准确性和重现性很好［16］。称取20 mg罗汉果多糖加入到5 mL质量分数为0.9%的氯化钠溶液，80℃搅拌至完全溶解。流动相为0.2%NaNO3和0.02%NaN3，测试温度25℃，进样量100μL，流速为0.4 mL/min。用Astra软件进行数据采集和分析。

1.2.7 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率测定 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）是在含有自由基的化学反应中作为一种监测反应的物质，常用于抗氧化成分的体外抗氧化性评价。分别配置浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mg/L的多糖母液于具塞试管中。设置5个测试组，2两个样品组分别对应罗汉果多糖和羧甲基化多糖，1个对照组和2个空白组来避免样品本身吸光度的影响。样品组为3.5 mL 0.1 g/L的DPPH的50%乙醇溶液+0.5 mL样品溶液；对照组为3.5 mL 0.1 g/L的DPPH的50%乙醇溶液+0.5 mL蒸馏水；空白组为3.5 mL无水乙醇+0.5 mL样品溶液。将不同质量浓度的多糖样品对应的3组溶液分别加入10 mL具塞试管中，充分混匀，避光静置30 min，在517 nm波长处测定吸光度，依次标记为A2、A0、A1。计算罗汉果多糖及其羧甲基化罗汉果多糖对DPPH·的清除率E［17］。

式中，A0为对照组吸光度；A1为空白组吸光度；A2为样品组吸光度。

1.2.8 羟基自由基清除率的测定 分别配置质量浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L的罗汉果多糖溶液和羧甲基化罗汉果多糖溶液于具塞试管中，设置5个测试组，2个样品组分别对应罗汉果多糖和羧甲基化多糖，1个空白组，2个对照组来避免样品本身吸光度的影响。样品组为样品溶液1 mL依次加入9 mmol/L FeSO4溶液1 mL、9 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液1 mL、8.8 mmol/L的H2O2溶液1 mL，充分混匀后37℃水浴30 min［18］；空白组则为用蒸馏水代替样品溶液再分别加入FeSO4溶液、水杨酸-乙醇溶液和H2O2溶液，对照组则为1 mL样品溶液加入3 mL无水乙醇溶液，计算对羟基自由基的清除率，计算公式如下。

式中，A1为样品组吸光度；A0为空白组吸光度；A2为对照组吸光度。

2 结果与分析

2.1 SEC/MALLS/RI分析结果

体积色谱（SEC）—示差检测（RI）—多角度激光光散射（MALLS）串联是检测生物大分子分子量最有效、最简便的方法之一，适用于检测多糖等大分子结构。本试验采用静态光散射得到罗汉果多糖在氯化钠溶液中的重均分子量Mw为5.369×104g/mol，数均分子量Mn为3.597×104g/mol，均方根旋转半径Rw为25.2 nm，多分散系数Mw/Mn用于说明聚合物的宽度（如多糖）分子量分布，Mw/Mn的值越大，分子量分布越宽。罗汉果多糖的多分散系数为1.493，说明提取出来的罗汉果多糖在水溶液中容易聚集，溶解度较小。

2.2 红外光谱分析结果

罗汉果多糖的红外光谱见图1，说明罗汉果多糖具有多糖类的红外特征吸收峰，3 267 cm-1为O-H的伸缩振动吸收峰，2 917 cm-1为C-H的伸缩振动吸收峰，1 591 cm-1为C-O伸缩振动吸收峰，1 412 cm-1为C-H弯曲振动吸峰，1 014 cm-1为糖环醚键C-OC的不对称伸缩振动吸收峰，构成了糖类特征吸收峰。

图1 罗汉果多糖和羧甲基化罗汉果多糖的红外光谱

羧甲基化罗汉果多糖的红外光谱见图1，3 304 cm-1为O-H的伸缩振动吸收峰，2 945 cm-1为C-H的伸缩振动吸收峰，1 100 cm-1为糖环中C-O-C的伸缩振动吸收峰，说明羧甲基化罗汉果多糖具有多糖类物质的特征吸收峰，对比羧甲基罗汉果多糖与罗汉果多糖的红外光谱可发现，羧甲基罗汉果多糖1 402 cm-1和1 602 cm-1处分别出现羧酸盐的对称伸缩振动吸收与反对称振动吸收峰。由此表明，反应实现了罗汉果多糖的羧甲基化修饰［19］。

2.3 单糖组成分析结果

通过酶解法提取多糖，提取率为3.64%，并使用氧化钠-氯乙酸法对罗汉果多糖进行了羧甲基化修饰，羧甲基化取代度为0.41。罗汉果多糖衍生化产物的总离子流见图2，与标准谱库对比，罗汉果多糖主要由呋喃糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、木糖、半乳糖等6种中性糖以及半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等酸性成分组成，结合面积归一法分析可得罗汉果多糖的单糖组分如表1所示。

图2 罗汉果多糖衍生化产物总离子流

表1 罗汉果多糖单糖组成

2.4 DPPH自由基清除活性

罗汉果多糖及其羧甲基化产物清除DPPH结果如图3所示。由图3可以看出，罗汉果多糖及其羧甲基化产物都具有清除DPPH的活性，在0～7 mg/mL内罗汉果多糖及其羧甲基化产物的DPPH清除率随浓度提高而快速增加，羧甲基化罗汉果多糖的DPPH清除率大于罗汉果多糖。在浓度为5 mg/mL时，通过计算得到罗汉果多糖和羧甲基化罗汉果多糖的P为0.002 36，为极显著；当浓度为10 mg/mL时P为0.041，小于0.05。羧甲基化罗汉果多糖DPPH清除能力相较于罗汉果多糖有显著提高。

图3 罗汉果多糖及羧甲基化罗汉果多糖清除DPPH测定结果

2.5 羟基自由基（·OH）清除活性

罗汉果多糖及其羧甲基化产物对羟基自由基（·OH）的清除作用如图4所示。由图4可知，罗汉果多糖及其羧甲基化产物均对Fenton反应产生的羟基自由基有清除作用，且随浓度的增加清除率逐渐升高。在浓度达到1.0 mg/mL时，羧甲基化罗汉果多糖对羟基自由基的清除率达到33.68%，罗汉果多糖的清除率达到31.33%，经过计算可知P为0.036，小于0.05。羧甲基化罗汉果多糖清除羟基自由基能力相对于罗汉果多糖有显著提高。在低浓度范围内，羧甲基化罗汉果多糖表现出较强的清除活性。

图4 罗汉果多糖及羧甲基化罗汉果多糖清除羟基自由基测定结果

3 结论

采用酶解法提取罗汉果多糖，多糖提取率3.64%，并使用氧化钠-氯乙酸法对罗汉果多糖进行了羧甲基化修饰，羧甲基化取代度为0.41。使用GC/MS技术分析罗汉果多糖单糖组分，发现罗汉果多糖主要由呋喃糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、木糖、半乳糖等6种中性糖以及半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等酸性成分组成。红外光谱表征显示，罗汉果多糖已成功进行羧甲基化修饰。通过SEC/MALLS/RI分析得到罗汉果多糖的重均分子量Mw为5.369×104g/mol，数均分子量Mn为3.597×104g/mol，均方根旋转半径Rw为25.2 nm，多分散系数Mw/Mn为1.493。

通过DPPH清除测定和羟基自由基清除测定，在相同质量浓度下羧甲基化罗汉果多糖抗氧化活性比罗汉果多糖要强，多糖在羧甲基化过程中会产生一些多糖的衍生物，这些衍生物的抗氧化基团更容易与自由基结合，从而产生更好的清除效果，另外多糖在羧甲基化过程中还会产生三股螺旋结构呈现无规则线团分布，已经有文献证明无规则线团分布的抗氧化性强于其他组分［20］。可见羧甲基化修饰能够改变罗汉果多糖的生物活性，提高罗汉果多糖的抗氧化性能，为罗汉果多糖和羧甲基化罗汉果多糖在食品保健中的应用提供理论基础。