毒害艾美耳球虫河南分离株早熟系选育及生物学特性研究

董 青

(河南牧业经济学院动物医药学院 ， 河南 郑州 450011)

鸡球虫病是由一种或几种鸡艾美耳球虫引起的以肠道病变为主要特征的、危害极为严重的全球性寄生虫病[1]。目前，本病的防治主要依赖药物，但是随着药物的广泛使用，抗球虫药药物残留问题和对生态环境的污染日趋严重，因此，疫苗免疫将成为预防球虫病的主流[2-3]。现有研究认为，鸡发生球虫病后可获得针对同种球虫的较强的免疫力，这也正是鸡球虫病活卵囊疫苗研究的基本原理。球虫的自然分离株感染鸡后均会不同程度地对鸡的生长性能产生影响，而具有良好免疫原性的减毒株可以克服这一缺点。目前，鸡球虫的致弱方法包括早熟选育、鸡胚适应及辐射致弱等，但其中早熟选育被认为是最成功的，且获得的早熟系在遗传上也相对最为稳定[4-6]。此技术在国内外被先后采用，英国Houghton Lab研制出由柔嫩艾美耳球虫(Eimerianecatrix,E.tenella)、堆型艾美耳球虫(E.acervulina)、 和缓艾美耳球虫(E.mitis)、早熟艾美耳球虫(E.praecox)、巨型艾美耳球虫(E.maxima)、布氏艾美耳球虫(E.brunetti)和毒害艾美耳球虫(E.necatrix)共7种早熟致弱虫株组成的球虫苗Paracox，该球虫苗在英国、荷兰和爱尔兰等国家投入市场使用，对防治鸡球虫病发挥了积极的作用[7-9]。

球虫在免疫保护力上存在着虫株差异，因此有必要对不同的虫株进行早熟选育。本试验对河南地区纯种E.necatrix进行早熟选育，选育成功后对E.necatrix早熟减毒株与母株的基本生物学特性进行比较研究，为早熟减毒株的早熟机理、早熟减毒株疫苗研制和研究鸡球虫病球虫种间和株间的分子生物学差异提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 刚出壳后的1日龄SPF鸡放入专用鸡盒运回实验室，在进行严格消毒的无球虫的育雏室内饲养至2～4周龄；禽舍的最初温度控制在30～35 ℃，每周递减2 ℃，直至室温，湿度控制在55%～65%；24 h光照；饲喂经高压灭菌的、无任何药物添加的SPF鸡全价育雏颗粒饲料；饮水引自天然泉水，采用纯净水设备经过三重反渗透净化处理，且加入紫外线和臭氧消毒，确保饮水无球虫。

1.2 虫株E.necatrix纯种虫株分离自河南省洛阳市某鸡场，分离、鉴定、纯化后保存，试验前经鸡体传代复壮。

1.3 早熟减毒株选育和潜隐期的研究 参照Jeffers等[7]建立的艾美耳属球虫早熟系选育法，将E.necatrix虫株孢子化卵囊用水离心洗涤(转速为3 000 r/min，时间为10 min)3～5次，以5×104个/羽的剂量经口接种SPF雏鸡，接种卵囊后的第4天起，收集雏鸡的新鲜粪便(1 次/h)，光学显微镜检测有无卵囊。第1次检测到卵囊的时间为潜隐期，收集卵囊进行孢子化培养，培养后的卵囊，以5×104个/羽 的剂量再次经口接种SPF雏鸡，直到潜隐期时间缩短，并至少连续3代稳定。

1.4 形态学研究 在光学显微镜下对选取的第30代E.necatrix早熟减毒株和母株各30个孢子化大小进行测量长、宽，并计算其形状指数和大小。

1.5 致病性研究 将3日龄SPF鸡随机分为8组，每组10只，隔离饲养，其中第1组为空白对照组，第2～4组 试验鸡经口灌服E.necatrix母株卵囊，剂量分别为1.0×104、5.0×104个/羽和10.0×104个/羽；第5～8组接种E.necatrix早熟减毒株卵囊，剂量分别为1.0×104、5.0×104、10.0×104个/羽和15.0×104个/羽。 期间观察试验鸡的死亡、寄生部位、对鸡的致病性，计算相对增重情况，并进行毒害艾美耳球虫病变记分[10]。

1.6 免疫原性研究 3日龄SPF鸡随机分为11组，每组10只，隔离饲养，其中第1组为空白对照组，不攻虫不免疫；第2组和第7组为攻虫对照组，只攻虫不免疫；第3～6组分别经口灌服免疫不同剂量的E.necatrix母株孢子化卵囊，剂量分别为200、500、1 000个/羽 和2 000个/羽，第8～11组接种E.necatrix早熟减毒株孢子化卵囊，剂量分别与母株相同。免疫后21 d各免疫组和攻虫对照组感染同种E.necatrix母株孢子化卵囊，剂量为5.0×104个/羽；攻虫感染后7 d 处死全部试验鸡，以死亡、相对增重及小肠病变评价E.necatrix母株和早熟减毒株免疫原性。

3日龄SPF鸡随机分为4组，每组10只，隔离饲养，其中第1组为空白对照组，不攻虫不免疫；第2组为攻虫对照组，只攻虫不免疫；第3组口服500个/羽 剂量的E.necatrix母株孢子化卵囊；第4组 口服500个/羽剂量的E.necatri早熟减毒株孢子化卵囊。除第1组外，第2～4组3 d后感染同种E.necatrix母株孢子化卵囊，剂量为5.0×104个/羽；并每天分别收集各组所有粪便，称重，进行每克粪便中卵囊记数，用麦克马斯特板计数法计算每克粪便卵囊数(OPG)，直到粪便中无球虫卵囊为止，计算排卵囊期内各组中每羽鸡排卵囊总量。

1.7 数据处理与统计 所有数据以平均数±标准差表示，采用SPSS 20.0 软件中单因素方差分析(One-way ANVOA)进行统计，P≤0.05为差异显著，P>0.05为差异不显著，均值采用Duncan法进行多重比较。

2 结果

2.1 早熟系选育 经过连续30代的早熟选育后，E.necatrix早熟减毒株的潜隐期缩短了23 h，由母株的144 h缩短至121 h，并且连续3代的潜隐期稳定在121 h，达到选育目标，各代次虫株均寄生于鸡体小肠中段。

2.2 形态学研究 经10×40倍显微镜观察显示，第30代E.necatrix早熟减毒株和母株的孢子化卵囊各30个，结果见表1。从表1可知，E.necatrix早熟减毒株卵囊的长、宽以及大小均比母株的小，但差异不显著(P>0.05)；早熟减毒株(1.24)的卵囊指数比母株(1.21)的稍大或者相等。

表1 30个随意挑选出的E. necatrix早熟减毒株和母株孢子化卵囊各度量值之间的对比Table 1 Comparison of the size of 30 haphazardly selected parent and precocious attenuated strain of E. necatrix

2.3 致病性研究 3日龄试验鸡在感染1.0×104个E.necatrix母株孢子化卵囊剂量(第2组)时，病变记分均1～2分，而感染同剂量的E.necatrix早熟减毒株孢子化卵囊(第5组)时，试验鸡无球虫临床症状，病变记分均≤+1分，母株和早熟减毒株组均未出现死亡现象；感染5.0×104个E.necatrix母株孢子化卵囊剂量以上(第3组)时均不同程度的表现出食欲不振、精神委顿、羽毛逆立、缩脖呆立、扎堆、排血便的症状，且相对增重率明显降低，小肠病变记分均≥+3分，试验鸡有10%的死亡，相对增重率为92.25%，而感染同剂量的E.necatrix早熟减毒株孢子化卵囊(第6组)时，试验鸡小肠病变记分为1～2分，存活率100%，相对增重率为95.53%；感染10.0×104个母株孢子化卵囊剂量(第4组)的试验鸡有40%的死亡，且相对增重率明显降低，为85.32%，鸡病变记分为3～4分，而感染同剂量的E.necatrix早熟减毒株组(第7组)毒力明显减弱，试验鸡小肠病变记分为2～3分，存活率仍为100%，相对增重率为93.42%；直至感染15.0×104个E.necatrix早熟减毒株孢子化卵囊(第8组)时，试验鸡有10%的死亡。感染E.necatrix早熟减毒与母株各剂量组试验鸡，剖检后显示均寄生于鸡体小肠中段。结果见表2。

表2 E.necatrix母株以及早熟减毒株孢子化卵囊对鸡的致病性试验结果Table 2 Virulence test results of parent and precocious attenuated strain of E.necatrix

用E.necatrix母株单卵囊后代感染10只鸡(5.0×104个/羽)，结果接种后第4、5天试验鸡开始出现临床褐色血便，第5天处死全部试验鸡后，剖检可见典型的小肠病变，小肠腔内有大量出血，浆膜面有红色或白色斑点。消化道其他部位没有鸡球虫病的病变(中插彩版图1)。

图1 E.necatrix母株感染鸡病变Fig.1 Lesions in chickens after infection by parent strain of E.necatrixA：黏膜层； B：浆膜层A：Mucous layer； B：Serosa layer

用E.necatrix早熟减毒株单卵囊后代感染10只鸡(5.0×104个/羽)，结果接种后发现其毒力较母株卵囊明显减弱(P<0.05)，试验鸡小肠病变记分≤+2分(中插彩版图2)。

图2 E.necatrix早熟减毒株感染鸡病变Fig.2 Lesions in chickens after infection by precocious attenuated strain of E.necatrixA：B：浆膜层； 黏膜层A：B：Serosa layer； Mucous layer

2.4 免疫原性研究 所有空白组的试验鸡均健康存活，肠道无病变(第1组)；攻虫对照组(第2组和第7组)存活率均为90%，所有试验鸡的小肠病变记分均≥+3分；免疫攻虫组(第3～6组和第8～11组)各试验鸡均健康存活，各剂量组试验鸡的肠道病变记分均≤+1分，200个/羽剂量的E.necatr免疫组即能产生较好的免疫保护力，说明E.necatrix母株和早熟减毒株均具有良好的免疫原性。结果见表3。

表3 E.necatrix母株以及早熟减毒株免疫原性试验结果Table 3 Immunogenicity test results of parent and precocious attenuated strain of E.necatrix

感染后第2天开始收集鸡粪，10只鸡粪混匀，按麦克马斯特板计数法计数。结果发现，7～10 d鸡粪中OPG最高，排卵囊期内各组中每羽鸡排卵囊总量结果见表4。结果显示，第1组未检测出E.necatrix卵囊，第3组和第4组及攻虫对照组均检测出球虫卵囊，且第1组与其他组差异性显著(P<0.05)；第3组(母株免疫组)排卵囊高峰期在接种后的第9天，第7～9天每羽鸡排卵囊总量分别为135×104、687×104个/羽和799×104个/羽；第4组(早熟减毒株免疫组)排卵囊高峰期在接种后的第8天，较母株提前了1 d，第7～9天每羽鸡排卵囊总量分别为486×104、623×104个/羽和110×104个/羽；两组免疫组极显著低于攻虫对照组(P<0.01)。说明免疫组均产生免疫作用，抑制了球虫卵囊的繁殖。

表4 接种后7～10 d的排卵囊总量 (×104个/羽)Table 4 Total amaunt of ovulatory sac 7-10 days after inoculation

3 讨论

3.1 早熟减毒株选育 球虫具有地区适应性，所以，本地区选育出的球虫早熟致弱虫株只能用于本地区的免疫预防，用在其他地区时，常未达到理想效果。本试验经过连续30代的早熟选育后，E.necatrix潜隐期缩短了23 h，并且连续3代传代潜隐期稳定。经研究表明，早熟减毒株潜隐期缩短的原因是其裂殖体发育快，裂殖生殖不完全，提前进入配子生殖[8-9]。要证明本试验所选育的早熟减毒株潜隐期缩短、发育加快的可能原因，以及所选育的早熟减毒株是否具有基因突变，还需做进一步的内生性发育以及遗传稳定性的研究。

3.2 卵囊大小测量 本试验经过连续30代早熟选育得到的E.necatrix早熟减毒株，E.necatrix早熟减毒株的孢子化卵囊大小为20.50 μm×16.55 μm，相对应的母株大小为21.50 μm×18.00 μm，早熟减毒株比母株略小。韩静芳等[6]和张志敏等[11]的研究结果表明，球虫卵囊的大小可能与其潜隐期及致病性有关系。造成早熟减毒株卵囊大小相对于母株偏小的原因可能是由于潜隐期缩短，最后一代裂殖体发育快，裂殖生殖不完全，提前进入配子生殖影响到虫体在体内的发育。

3.3 毒力及致病性测定 本试验的毒力性试验可以看出，鸡感染E.necatrix早熟减毒株时3个剂量组(1×104、5×104个/羽和10×104个/羽)死亡率分别为0、0、0，而母株在感染同剂量时死亡率分别为0、10%、40%；3日龄试验鸡在感染1.0×104个E.necatrix母株孢子化卵囊剂量时，病变记分均1～2分，而感染同剂量的E.necatrix早熟减毒株孢子化卵囊时，试验鸡无球虫临床症状，病变记分均≤1分。这些指标表明，E.necatrix早熟减毒株的致病性明显低于母株。这与之前刘群等研究早熟柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)的结果相似。刘群等[12]对E.tenella的研究结果显示，感染0.1×104个/羽母株卵囊的致病力相当于感染10×104个/羽早熟减毒株卵囊的致病力。导致早熟减毒株毒力减弱的可能原因：在球虫生活史当中，最后一代裂殖生殖阶段是致病性最强的阶段，由于早熟减毒株裂殖体发育快，裂殖生殖不完全，提前进入配子生殖，导致了早熟减毒株繁殖力有所减弱。由于早熟减毒株裂殖体变小所以对鸡肠道组织的损伤减轻，只有在超高剂量的早熟减毒株感染时才会产生血便，但血便量不仅少而且持续时间短，所以早熟减毒株致病性降低，临床症状不明显，可作为球虫疫苗的候选虫株。

3.4 免疫原性测定 球虫感染宿主后可在体内诱导产生保护性免疫反应。自然感染球虫中，球虫生活史早期的无性阶段是诱导保护性免疫的最重要的阶段[13]。E.necatrix早熟减毒株在球虫发育史中缺失了1或2代裂殖生殖，因而不影响其免疫原性。本试验的免疫原性试验可以看出，200个/羽剂量的E.necatrix早熟减毒株和母株即能产生较好的免疫保护力，免疫组增重和病变记分与母株的相当，说明E.necatrix早熟减毒株保持了母株良好的免疫原性。这与Davies、Hein、Shirley等、Montes等得出的早熟减毒株的免疫原性与母株相比较无明显变化结果一致[14-17]。但李建梅等、Chapman等认为毒害艾美耳球虫的免疫原性在鸡的7种球虫中最弱，并说明鸡球虫的免疫研究中，不同种球虫的抗原存在差异，同种不同株间的抗原也存在差异，同一个体的不同发育阶段抗原也不尽相同[18-19]。

本试验获得了河南省E.necatrix早熟减毒株，发现其具有潜在期明显缩短、致病性较母株弱、保持了母株免疫原性等球虫早熟减毒株的独特特点，为河南省鸡球虫活卵囊疫苗的研制提供了科学依据。