背根神经节环磷酸腺苷/蛋白激酶A信号通路在多西他赛化疗所致大鼠神经病理性疼痛中的作用

邓淑文 杨艳 夏红星

南华大学衡阳医学院，附属南华医院，1疼痛科，2胃肠外科（湖南衡阳421002）

多西他赛（DTX）是紫杉烷类抗肿瘤药物中应用较为广泛的一种化疗药物，对多种实体肿瘤具有治疗作用。然而，化疗引起的神经病理性疼痛（CINP）是DTX 化疗引起的常见副作用，且具有可持续性和剂量限制性［1-2］。如何有效控制神经病理性疼痛一直是疼痛医学领域的热点和难点，特别是CINP。环磷酸腺苷（cAMP）/蛋白激酶A（PKA）信号通路是由G 蛋白偶联受体介导的细胞内经典信号通路之一，广泛参与细胞分化、增殖、凋亡、基因转录等众多生物学过程的调控［3-4］。贺端端等［5］研究表明，cAMP/PKA 信号通路在骨癌痛大鼠背根神经节和脊髓组织中异常活化，在骨癌痛的产生和维持中起着重要作用。ZHANG 等［6］研究报道抑制大脑伏隔核中cAMP/PKA 信号通路的活化对坐骨神经损伤致单神经病变引发的神经病理学疼痛具有镇痛效果。cAMP/PKA 信号通路在外周痛觉过敏的形成及神经病理性疼痛的调节过程扮演重要作用，然而cAMP/PKA 信号通路是否参与CINP尚未明确。为此本研究拟建立DTX化疗诱导的神经病理性疼痛模型大鼠，探讨cAMP/PKA 信号通路抑制或激活对模型大鼠痛觉变化的影响，以明确该信号通路在CINP 发生发展中的作用，为治疗化疗痛寻找潜在靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF 级雄性SD 大鼠60 只，鼠龄6周龄，体质量200 ～220 g，由湖南嘉泰实验动物有限公司提供，动物生产许可证编号：SCXK（湘）2019-0003。大鼠饲养于12/12 h 明暗交替的环境中，其中温度为22 ～24 ℃、相对湿度为45%～60%，且自由饮水摄食。

1.2 主要试剂及仪器 多西他赛注射液购自江苏恒瑞医药股份有限公司；PKA 抑制剂H-89 和PKA激动剂SP-CAMP 购自美国MedChemExpress 公司；大鼠cAMP ELISA 试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司；IL-1β、IL-6、TNF-α测试盒均购自南京建成生物工程研究所；胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体、蛋白激酶A（PKA）C 亚基（PKAc）抗体、环磷酸腺苷效应元件结合蛋白（CREB）抗体、磷酸化CREB（p-CREB）（Ser133）抗体、GAPDH 抗体购自美国CST 公司；Alexa Fluor 488 标记山羊抗兔IgG（H+L）和BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；辣酸根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔IgG 购自武汉博士德生物工程有限公司；VonFrey 电子测痛仪（BIO-EVF3）购自法国Bioseb 公司；热板测痛仪（PL-200）购自四川科仪诚科技有限公司；酶标仪（ELx8000）购自美国Bio-Tek公司；荧光显微镜（Ti2）购自日本尼康株式社。

1.3 模型构建及分组 采用随机数字表法将60只SD 大鼠分成正常对照组、模型组、PKA 抑制剂H-89 组（H-89 组）和PKA 激动剂SP-CAMP 组（SPCAMP组），每组15只。除正常对照组外，其他各组大鼠均于每日上午9：00 时通过尾静脉注射10 mg/kg多西他赛注射液，每天1 次，连续10 d，构建化疗所致神经病理疼痛大鼠模型［7］。大鼠第1 次给予多西他赛注射液注射当天视为第1 天，H-89 组和SPCAMP 组大鼠于第1 天下午3：00 时分别鞘内注射PKA 抑制剂H-89（10 μmol/5μL）和PKA 激动剂SPCAMP（40 nmol/5μL），正常对照组和模型组给予等量生理盐水注射，每日1 次，连续10 d。

1.4 行为学测试 将所有大鼠提前置于测试笼连续适应3 d，每次2 h。于第11 天分别使用电子Von Frey 测痛仪和热板测痛仪测定大鼠机械缩足反射阈值（MWT）和热缩足反射潜伏期（TWL）。测试过程中出现抬足反射时视为阳性反应，并记录出现抬足反射时测痛仪显示的示数。左右足各测3 次，每次间隔5 min，最后取6 次测定的平均值，分别作为最终的MWT 值和TWL 值。行为学测试结束后处死大鼠，分别取大鼠L4-L6 背根神经节和脊髓组织用于后续实验检测。

1.5 ELISA 检测 取大鼠背根神经节或脊髓部分组织，制备成组织匀浆，根据试剂盒说明书进行操作，用酶标仪测定450 nm 波长处吸光值（A450 值），再根据标准曲线计算背根神经节中cAMP含量以及脊髓组织中炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平。

1.6 免疫荧光实验 取大鼠脊髓组织，放入40 g/L多聚甲醛中固定24 h，再置于30%蔗糖溶液中脱水48 h。将背根神经节组织制作成冰冻切片，切片厚度8 μm。取出冰冻切片，滴加1.2%H2O2室温避光作用10 min，1×PBS 洗涤3 次，0.3% Triton X-100 处理30 min，1×PBS 洗涤3 次，滴加2% BSA 室温封闭1 h，1×PBS 洗涤3 次，滴加GFAP 抗体（1∶300），4℃孵育过夜，1×PBS 洗涤3 次，滴加Alexa Fluor 488 标记山羊抗兔IgG（H+L）避光孵育1 h，1×PBS 洗涤3 次，滴加防淬灭剂，中性树脂封片，荧光显微镜下拍照观察。每张切片随机取5 个视野，采用Image J 软件测量GFAP 平均荧光强度。

1.7 Western blot 实验 取大鼠背根神经节部分组织，按照每50 mg 组织加入0.5 mL RIPA 裂解液，冰上匀浆，超声破碎。4 ℃条件下15 000×g 离心30 min，取上清液即为所抽提的蛋白溶液，采用BCA 法测定蛋白浓度。取等量蛋白置于沸水浴变性后上样，SDS-PAGE 凝胶电泳分离目的蛋白，并转移至PVDF 膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，TBST 洗涤3 次，分别加入PKAc、CREB、p-CREB、GAPDH 等抗体，4 ℃孵育过夜，TBST 洗涤3 次，加入HRP 标记山羊抗兔IgG 二抗室温孵育1 h，TBST洗涤3 次，滴加ECL 超敏发光液，显影，采用Image J 软件分析条带灰度值。

1.8 统计学方法 采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析，计量数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，事后两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经病理性疼痛变化 见表1，与正常对照组比较，模型组大鼠MWT 和TWL 值均显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，H-89 组大鼠MWT和TWL 值均显著增加（P＜0.05），而SP-CAMP 组大鼠MWT和TWL值均显著降低（P＜0.05）。

表1 各组大鼠机械痛觉和热痛觉阈值比较Tab.1 Comparison of mechanical pain threshold and thermal pain threshold of rats in each group ±s

表1 各组大鼠机械痛觉和热痛觉阈值比较Tab.1 Comparison of mechanical pain threshold and thermal pain threshold of rats in each group ±s

注：与正常对照组比较，*P ＜0.05；与模型组比较，#P ＜0.05

组别正常对照组模型组H-89 组SP-CAMP 组MWT（g）18.69±1.37 8.87±1.09*14.36±2.07#4.25±0.86#TWL（s）13.06±1.07 7.44±2.11*11.85±1.68#5.07±1.19#

2.2 各组大鼠脊髓中星形胶质细胞活化情况 4组大鼠脊髓组织中均存在星形胶质细胞活化标志物GFAP蛋白的表达。与正常对照组比较，模型组大鼠脊髓组织中GFAP平均荧光强度显著增加（P＜0.05）；与模型组比较，H-89 组大鼠脊髓组织中GFAP 平均荧光强度显著降低（P＜0.05），而SP-CAMP组大鼠脊髓组织中GFAP平均荧光强度显著增加（P＜0.05）。见图1。

图1 免疫荧光检测脊髓组织中GFAP 蛋白表达（100×）Fig.1 Expression of GFAP in spinal cond detected by immunofluorescence（100×）

2.3 各组大鼠脊髓组织中炎症因子IL-1β、IL-6 和TNF-α水平 见表2，与正常对照组比较，模型组大鼠脊髓组织中IL-1β、IL-6 和TNF-α水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，H-89组大鼠脊髓组织中IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著降低（P＜0.05），而SP-CAMP 组大鼠脊髓组织中IL-1β、IL-6 和TNF-α水平显著升高（P＜0.05）。

表2 各组大鼠脊髓组织中IL-1β、IL-6 和TNF-α水平比较Tab.2 Comparison of IL-1β、IL-6 and TNF-α Level in spinal cord tissue of rats in each group ±s，pg/mg

表2 各组大鼠脊髓组织中IL-1β、IL-6 和TNF-α水平比较Tab.2 Comparison of IL-1β、IL-6 and TNF-α Level in spinal cord tissue of rats in each group ±s，pg/mg

注：与正常对照组比较，*P ＜0.05；与模型组比较，#P ＜0.05

组别正常对照组模型组H-89 组SP-CAMP 组IL-1β 47.24±7.53 176.58±14.22*82.22±8.02#236.66±21.06#IL-6 13.07±3.38 67.15±7.57*31.27±5.68#90.47±10.44#TNF-α 87.69±8.65 207.95±18.36*140.25±11.02#281.21±37.35#

2.4 各组大鼠背根神经节组织中cAMP/PKA 信号通路蛋白表达情况 见图2，与正常对照组比较，模型组大鼠背根神经节中cAMP 含量显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，H-89 组和SP-CAMP 组大鼠背根神经节中cAMP 含量无显著性变化（P＞0.05）。如图3 所示，与正常对照组比较，模型组大鼠背根神经节中PKAc 和p-CREB 蛋白表达水平显著上调（P＜0.05）；与模型组比较，H-89 组大鼠背根神经节中PKAc 和p-CREB 蛋白表达水平显著下调（P＜0.05），而SP-CAMP 组大鼠背根神经节中PKAc和p-CREB蛋白表达水平显著上调（P＜0.05）；4 组大鼠背根神经节中CREB 蛋白表达水平相互比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2 ELISA 检测大鼠背根神经节中cAMP 含量Fig.2 Detection of camp in rat dorsal root ganglion by ELISA

图3 Western blot 检测大鼠背根神经节中PKAc、CREB、p-CREB 蛋白表达水平Fig.3 PKAc，CREB and p-CREB expression levels were detected by Western blot

3 讨论

根据最新调查研究［8］显示，2018年中国癌症发病率及死亡率均已位列全球第一，分别占全球新增癌症病例的21.02%和新增癌症死亡病例的23.92%。随着癌症发病率的逐年上升，化疗药物的使用也日益广泛，然而CINP 问题一直困扰着患者和医务人员。有研究［9-10］显示，近四成化疗患者会出现神经病理性疼痛，主要表现为四肢远端麻木、烧灼痛或刺痛，具有浓度依赖性。CINP 不仅增加了癌症患者的痛苦，还极大限制了化疗药物的使用，并且其具体病理机制目前还不清楚。本研究结果显示，cAMP/PKA 信号通路在多西他赛诱导的CINP 大鼠背根神经节中异常活化，抑制该通路的活化可显著提高CINP 大鼠机械痛阈值和热痛阈值，并抑制脊髓星形胶质细胞的活化以及炎症因子的释放，若激活该信号通路则表现出完全相反的作用，提示cAMP/PKA 信号通路可能在多西他赛诱导的CINP 过程中发挥重要作用。

cAMP/PKA 信号通路的活化过程由胞外信号通过与细胞膜上G 蛋白偶联受体结合，将胞外信号传递至细胞内，并上调胞内第二信使cAMP 水平，从而激活PKA，导致PKA 催化亚基（PKAc）的解离并进入细胞核，使下游靶蛋白CREB 的Ser133位点发生磷酸化修饰，激活相关靶基因的转录［11］。众多研究［12-13］显示，cAMP/PKA 信号通路参与多种病理状态下外周痛觉过敏的形成与维持以及神经病理性疼痛的调节。本研究结果显示，CINP 大鼠L4-L6 背根神经节中cAMP 含量以及PKAc 蛋白和p-CREB 水平显著升高，说明CINP 大鼠背根神经节中cAMP/PKA 信号通路异常活化。为了进一步探讨cAMP/PKA 信号通路异常活化是否参与CINP过程，本研究采用PKA 抑制剂H-89 和激动剂SPCAMP 对该信号通路进行干预。结果显示，H-89干预可显著抑制CINP 大鼠背根神经节中PKAc 蛋白的表达并降低p-CREB 水平，而SP-CAMP 干预可显著上调CINP 大鼠背根神经节中PKAc 蛋白的表达及p-CREB 水平，证实H-89 和SP-CAMP 对cAMP/PKA 信号通路发挥了阻断或激活作用。此外，由于H-89 和SP-CAMP 的干预靶点是PKA，因此其对cAMP 水平无影响，本研究结果也证实H-89 和SPCAMP 干预对CINP 大鼠背根神经节中cAMP 含量无显著影响。本研究进一步发现，H-89 干预可显著提高CINP 大鼠机械痛阈值和热痛阈值，而SPCAMP 干预后CINP 大鼠机械痛阈值和热痛阈值进一步降低。ZHU 等［14］研究也证实，cAMP/PKA 信号通路在骨癌疼大鼠背根神经节中异常活化，采用PKA 抑制剂Rp-cAMPS 可显著延迟或逆转骨癌诱导的热痛觉过敏和机械性痛觉过敏，说明cAMP/PKA信号通路的激活可能参与CINP的维持。

星形胶质细胞是神经系统中数量较多、分布较广的神经胶质细胞，其常响应神经损伤刺激而活化，在周围神经损伤引起的慢性神经病理性疼痛中起关键作用［15］。脊髓星形胶质细胞活化可释放活性介质，包括炎性介质IL-1β、IL-6 和TNF-α，再通过旁分泌途径增强脊髓伤害性突触传递的兴奋性及疼痛信号传导，参与调控疼痛的发生，与痛觉过敏的产生和维持密切相关［16］。李立等［17］研究显示，在脊髓神经损伤致神经病理性疼痛模型诱导过程中，脊髓星形胶质细胞持续活化。多项研究［18-19］显示，抑制脊髓星形胶质细胞活化可减轻疼痛感。本研究结果显示，CINP 大鼠脊髓中星形胶质细胞活化标志物GFAP 蛋白表达增加，说明在CINP 中脊髓星形胶质细胞也处于较高水平的活化状态。同时，CINP 大鼠脊髓组织中炎症因子IL-1β、IL-6 和TNF-α水平也显著提高，表明星形胶质细胞活化介导的炎症因子释放参与CINP 过程。有研究［15］显示，cAMP/PKA 信号通路的激活可促进星形胶质细胞的活化。为此，推测cAMP/PKA 信号通路参与调控的CINP 可能与脊髓星形胶质细胞活化有关。本研究结果进一步显示，H-89 干预可显著抑制CINP 大鼠脊髓中GFAP 蛋白的表达并降低脊髓中IL-1β、IL-6 和TNF-α水平，而SP-CAMP干预后CINP 大鼠脊髓中GFAP 蛋白的表达及IL-1β、IL-6 和TNF-α水平显著增加，说明CINP 大鼠背根神经节中cAMP/PKA 信号通路的活化促进了脊髓星形胶质细胞的活化，并释放炎症因子，进而介导神经病理性疼痛。

综上所述，cAMP/PKA 信号通路在CINP 模型大鼠背根神经节中被激活，该通路的激活进一步介导脊髓星形胶质细胞的活化并释放炎症因子，进而介导CINP的发生发展。因此，靶向抑制cAMP/PKA 信号通路或许为临床解决CINP 提供理论依据。