多元复合调理剂对镉砷污染农田土壤微生物群落结构的影响

曾 鹏,蒋 毅,辜娇峰,周 航,刘 雅,廖柏寒 (中南林业科技大学环境科学与工程学院,湖南 长沙 410004)

土壤钝化修复技术主要是通过添加化学调理剂改变土壤中重金属的赋存形态来降低农作物对重金属的吸收,是一种有效的农田重金属污染土壤修复技术[1-3].目前,常用于重金属污染农田土壤修复的调理剂有碳酸钙[4]、石灰[5]、生物炭[6]、海泡石[7]等.镉(Cd)和砷(As)是常见的土壤污染元素.一般而言,污染土壤中Cd主要以Cd2+,而As主要以AsO43-和AsO33-形态存在[8],故这两种元素在土壤中赋存形态的差异使单一土壤调理剂无法同时有效钝化 Cd和As,减少农作物对 Cd和As的吸收与转运.因此,大量研究开始转向利用多种调理剂进行复合后用于修复农田Cd和As复合污染农田土壤.

多元复合调理剂已广泛用于修复农田As和Cd复合污染土壤[2,9-10].研究表明,施用石灰石、海泡石和硫酸铁三元复合调理剂能显著降低土壤可交换态Cd和As含量和水稻Cd和As吸收[9].施用碳酸钙、偏高岭土和钙镁磷肥元复合调理剂,水稻糙米中Cd和As含量降低,且与土壤中Cd和As各形态含量显著相关[11].通过原位添加羟基磷灰石、沸石和生物炭三元复合调理剂可有效降低水稻对 Cd和 As的吸收,并促进水稻增产[12].碱性肥料和硅钙调理剂组配可降低水稻根系对土壤中 Cd和 As吸收,稻米中 Cd和 As含量分别显著降低 43.8%和32.1%[10].因此,利用多元调理剂进行复合后可同时控制水稻对 Cd和 As的吸收,降低糙米 Cd和As含量.

土壤微生物是维持土壤生物学特性的重要组成部分[13],其中微生物群落和多样性的变化可用来研究多元调理剂对重金属污染土壤的生态调节作用,并判断多元调理剂对农田土壤生态安全的影响.然而,大量研究仅仅集中于多元调理剂对土壤重金属有效性以及水稻对Cd和As吸收和富集特征的影响,而忽视了添加的调理剂对土壤中微生物群落和土壤生态安全的影响.有研究表明,石灰配施腐殖酸或生物质炭可对降低土壤中重金属的生物有效性,增强土壤微生物基础呼吸强度和土壤微生物量碳含量[14].施用海泡石、石灰、秸秆生物炭和螯合铁肥可改变土壤中重金属赋存形态进而改变农田土壤微生物群落结构[15].施用有机肥和石灰石可显著提高重金属污染土壤的微生物活性[16].因此,土壤微生物群落结构的变化一定程度可有效反应添加调理剂对农田土壤生态安全的影响.目前,大量研究表明,石灰石、铁粉、硅肥和钙镁磷肥在调控水稻Cd和As吸收方面有突出的效果[11,17-19].然而,基于多元土壤调理剂对污染土壤中微生物群落及其生态安全的影响鲜有研究.

本研究通过温室盆栽试验,研究添加多元土壤调理剂(石灰石、铁粉、硅肥和钙镁磷肥)对土壤基本理化性质、As和Cd的生物有效性、微生物群落结构和农田生态安全的影响,探究多元复合调理剂作用下土壤环境因子与微生物群落结构的联系,评估多元复合调理剂对农田土壤生态环境质量的影响,以期为应用多元复合调理剂原位修复和治理 Cd和As复合污染农田土壤提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 供试土壤与材料

供试土壤采自湖南省郴州市临武县某Cd和As复合污染的稻田耕作表层土壤(经度 25°19'24",纬度112°35'22").供试土壤的基本物理化学性质见表1.与《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准(试行)》(GB 15618—2018)[20]风险筛选值相比,该农田土壤属于Cd和As复合污染.收集的土壤经自然风干后过5mm筛后用于盆栽试验.

表1 供试土壤的基本物理化学性质Table 1 Basic physiochemical properties of tested soil

多元复合调理剂(LISP)按一定质量比的石灰石、铁粉、硅肥和钙镁磷肥混合组成.石灰石采购自石天津市大茂化学试剂厂,主要成分为重质碳酸钙.铁粉采购自购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司,主要成分为零价铁.硅肥采购自天津市风船化学试剂科技有限公司,主要成份为 Na2SiO3·9H2O.钙镁磷肥采购自湖南省宁乡县钙镁磷肥厂,其中 P2O5含量为12%～16%,CaO含量为25%～30%,MgO含量为8%.石灰石、铁粉、硅肥和钙镁磷肥中原始 Cd和As含量均未检测出.

水稻(Oryza sativa L.)品种选用晚稻品种深优5814(杂交籼稻,湖南金色农丰有限公司).

1.2 试验设计

4kg过 5mm 筛的土壤装入圆形塑料桶(桶高29cm,内径 25cm)后,分别添加质量比为 0%(CK)、0.1%(T1)、0.2%(T2)和0.4%(T3)的LISP复合调理剂.混合均匀后,每盆加入 1.12g CO(NH2)2、0.84g(NH4)3PO4和0.88g K2CO3作为基肥.每个处理3次重复.保持田间持水率下,培养20d后,移栽无污染土壤培育、长势良好的水稻幼苗(五叶一心),每盆1穴2株.水稻种植期浇灌自来水保持一定的水层深度(2～4cm),水稻收割前2～3d停止灌溉至表层土壤发白.水稻成熟后,收集水稻根际土壤,一部分用于土壤基本理化性质的测定,一部分新鲜土壤样品用于DNA的提取.

1.3 测试与分析

土壤基本物理化学性质(pH值、阳离子交换量、有机质、碱解氮、总磷和有效磷)根据鲁如坤[21]的方法进行分析和测定.土壤总 Cd采用王水-高氯酸混酸消解[21],总 As采用(1+1)王水水浴法消解[21].土壤有效态Cd和As采用DTPA浸提[22-23].消解和浸提液中Cd含量采用ICP-AES(ICP 6300,Thermo)测定.消解和浸提液中As含量均用原子荧光分光光度计(AFS-8220,北京吉天仪器有限公司)测定.国家标准物质土壤(GBW-070009)和空白试验用于样品分析过程的质量控制.Cd和As回收率分别为90.1%～105.3%和90.0%～110.0%.

1.4 土壤DNA提取和微生物群落结构分析

采用 NucleoSpin®96Soil土壤 DNA提取土壤DNA,-20℃保存.细菌V3 V4可变区采用正向引物338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3')和反向引物806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')进行PCR扩增(9902,96well PCR仪,上海吉泰依科赛生物科技有限公司).PCR扩增反应条件为:95℃预变形 5min;25个循环(95 ℃ ,3 0s;50 ℃ , 3 0s;72℃,40s);72 ℃ ,7min.PCR 扩增产物经过纯化、定量和均一化形成测序文库,质检合格的文库用 Illumina HiSeq 2500(美国Illumina公司)进行测序.

1.5 数据处理

采用Microsoft Excel 2016分析数据.采用SPSS 16.0对数据进行显著性检验和相关性分析.使用Mothur(version v.1.30)软件,对样品α-多样性指数进行计算和评估.土壤微生物群落的主成分分析(PCA)、非度量多维标定法(NMDS)、热图和Mantel检验分析等在百迈克生物云平台完成.采用 Canoco 5.0对微生物群落结构进行冗余分析.

2 结果与分析

2.1 LISP处理下土壤基本理化性质的变化

从表2可看出,随着LISP添加量的增加,土壤有机质和碱解氮含量无显著变化,但土壤pH值、阳离子交换量、有效磷和总磷含量呈现增加趋势.在 T1和T2处理下,土壤pH值、阳离子交换量和总磷含量较CK相比无明显影响;而在T3处理下,土壤pH值较CK处理显著(P＜0.05)提高0.57单位;土壤阳离子交换量较对照显著(P＜0.05)提高57.64%.与CK处理相比,T1和 T2处理下土壤有效磷含量分别显著(P＜0.05)提高26.59%和25.00%,尤其在0.4% LISP处理下,土壤有效磷和总磷含量分别显著(P＜0.05)提高130.6%和18.38%.本研究结果表明,添加0.1%～ 0.2%的LISP对土壤的基本理化性质无明显影响,而0.4% LISP处理可有效提高土壤pH值、阳离子交换量和土壤磷含量.

表2 LISP处理下土壤基本理化性质的变化Table 2 Change of basic physiochemical properties in the soil under the LISP treatment

2.2 LISP对土壤Cd和As有效性的影响

LISP对土壤Cd和As有效性的影响见图1.与对照(CK)相比,T1—T3处理下土壤有效态 Cd和 As含量分别显著(P＜0.05)降低 10.25%～21.76%和 10.60%～16.39%,表明 LISP可同时有效降低土壤中Cd和As的生物有效性.其中,土壤有效态 Cd含量与 pH值呈负相关;土壤有效态As含量与有效磷含量显著(r=—0.644,P＜0.05)负相关;土壤阳离子交换量分别与有效态 Cd(r=-0.778,P＜0.01)和有效态 As(r=-0.715,P＜0.01)显著负相关(表3).

表3 土壤Cd和As有效态含量与土壤基本理化性质的相关性分析Table 3 The relationship between contents of available Cd and As and basic physicochemical properties in the soil

图1 LISP处理下土壤中有效态Cd和As含量的变化Fig.1 Change of available Cd and As contents in soil under LISP treatment

2.3 LISP对土壤微生物群落多样性的影响

LISP处理下土壤微生物群落的OTUs数量和多样性指数的变化见表4.在T1、T2和T3处理下,土壤中微生物的OTUs数量和Shannon多样性指数与CK处理相比无显著差异,而ACE和Chao指数出现增加趋势,但差异不显著,表明LISP对土壤中微生物群落的丰富度和多样性的无明显影响.

表4 LISP处理下对土壤微生物α-多样性的影响Table 4 Effects of LISP treatment on soil microbial α-diversity

基于OTU分类水平,采用主成分分析(PCA)和非度量多维标定法(NMDS)研究添加不同量的LISP对土壤微生物β—多样性的影响(图2).从PCA可看出,PC轴 1和 2的贡献率分别为 70.90%和19.06%,累计贡献率89.96%,同时 NMDS分析的强度小于 0.2,表明 PCA和 NMDS可有效解释不同LISP添加量下土壤微生物群落结构的相似性.从图2可看出,T1、T2和 T3处理下土壤微生物群落与CK处理相比具有显著差异,进一步表明添加 LISP可有效改变污染土壤微生物群落.且T1、T2和T3处理之间的土壤微生物群落结构也具备显著差异,表明LISP添加量的差异亦可进一步改变土壤微生物群落结构.

图2 LISP处理下对土壤微生物β-多样性的影响Fig.2 Effects of LISP treatment on β-diversity of soil microbial community

2.4 LISP对土壤微生物群落结构的影响

添加LISP后,土壤中的微生物主要隶属于厚壁菌门(Firmicutes,占比 21.88%～37.51%)、变形菌门(Proteobacteria,占比 17.36%～22.48%)、绿弯菌门(Chloroflexi,占 比 11.81%～16.94%)、放线菌门(Actinobacteria,占比 6.61%～13.66%)、酸杆菌门(Acidobacteria,占比 6.24%～8.48%)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae,占 比 5.40%～9.05%)、 拟 杆 菌 门(Bacteroidetes,占 比 3.15%～5.82%)、 浮 霉 菌 门(Planctomycetes,占比 1.18%～9.58%)、疣微菌门(Verrucomicrobia,占比 0.76%～2.07%)等(图 3),表明上述微生物是污染土壤中主要优势物种.同时,T1—T3处理下土壤中厚壁菌门、放线菌门和浮霉菌门等门水平物种的相对丰度增加,而绿弯菌门、酸杆菌门和疣微菌门等门水平物种的相对丰度降低(图3).

图3 LISP处理下土壤主要门水平物种分布Fig.3 The distribution of main microorganisms at phylum level under LISP treatment

从属水平可进一步看出,LISP可影响土壤中微生物群落的组成.在 T3处理下,节杆菌属(Arthrobacter)、虚构芽胞杆菌属(Fictibacillus)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、Defluviicoccus、水球菌属(Aquisphaera)、Singulisphaera、Candidatus Udaeobacter、类芽孢杆菌(Paenibacillus)等微生物的相对丰度较对照升高,而地杆菌属(Geobacter)、Syntrophorhabdus、纤绳菌属(Leptolinea)、厌氧粘细菌(Anaeromyxobacter)、马赛菌属(Massilia)等微生物的相对丰度较对照明显降低(图4).

图4 LISP处理下土壤主要属水平物种分布Fig.4 Soil bacterial community at genus level under LISP treatment

2.5 土壤环境因子与微生物群落结构的联系

将细菌主要门水平微生物与土壤环境因子结合进行冗余分析(RDA),结果如图5所示.RDA分析的轴 1和轴 2对土壤细菌群落的解释量分别为63.07%和13.43%,表明RDA分析能有效反应微生物群落与土壤环境因子之间的联系.从图 5可看出,土壤pH值、有效磷、总磷、阳离子交换量、以及土壤有效态As和Cd与土壤微生物群落结构呈现正相关,其中pH值、有效磷和有效态As与微生物群落呈显著正相关(表5).

图5 LISP处理下土壤微生物群落的冗余分析Fig.5 Redundancy analysis of soil microbial community under LISP treatment

3 讨论

本研究中添加 0.4%LISP可显著改变土壤的基本理化性质,其中土壤pH值、阳离子交换量、有效磷和总磷含量显著提高.土壤pH值上升的原因可能与LISP中含有碱性的石灰石和钙镁磷肥,可一定程度提高土壤pH值.与史磊等[24]研究发现石灰配施钙镁磷肥可显著提高土壤pH值的研究结果一致.土壤阳离子交换量含量增加的原因则可能与随着 LISP添加量的增加,进而携带大量的 Ca2+、Mg2+、Fe3+等阳离子进入土壤有关.辜娇峰等[25]发现羟基磷灰石、沸石和改性秸秆炭组成的复合调理剂可显著提高土壤的阳离子交换量,与本研究结果一致.土壤有效磷和总磷提高的原因则与钙镁磷肥是复合调理剂的主要成分,一定程度上提高土壤的磷含量有关.鄢德梅等[26]研究发现钙镁磷肥分别与石灰、海泡石复合可显著提高土壤有效磷,与本研究结果一致.本研究结果表明,添加0.4% LISP处理可显著提高土壤pH值、阳离子交换量和土壤磷含量.

LISP可有效降低土壤中Cd和As的生物有效性.其中,有效态Cd含量与土壤pH值和阳离子交换量呈负相关(表 3).有研究表明,土壤有效态 Cd含量降低与土壤pH值和阳离子交换量的提高有关[2].土壤pH值升高会增强土壤中带负电荷的胶体和OH–与Fe、Mn等离子形成羟基化合物对Cd离子的吸附能力,使Cd2+形成 Cd(OH)2或 CdCO3,从而降低土壤中Cd的生物有效性[9].同时,LISP成分中石灰石和钙镁磷肥所含的 Ca2+能与 Cd2+发生共沉淀,从而促进土壤中Cd向残渣态Cd的转化,降低土壤中Cd的生物有效性[27].硅也可通过形成硅酸盐络合物和硅醇基(Si—OH)来改变土壤中 Cd的赋存形态,从而降低 Cd的生物可利用性[28].LISP复合调理剂成分中石灰石和钙镁磷肥所含的Ca亦能与As形成砷酸钙等难溶性沉淀,增加土壤吸附As的能力,从而影响土壤中 As的生物有效性[26].硅肥可通过专性吸附,钙镁磷肥中的磷酸盐可通过络合反应等方式来降低土壤中As的生物有效性[29-30].土壤有效态As含量与有效磷含量显著(r=—0.644,P＜ 0.05)负相关(表 3).铁粉可通过氧化还原反应生成 FeOOH,进一步氧化形成无定形的铁氢氧化合物(am—FeOOH),上述产物可为Cd和As提供更多的吸附位点[18].因此,LISP中多种材料的相互作用可同时有效钝化污染土壤中的Cd和As.

土壤微生物群落的结构和多样性易受重金属污染的影响,因此土壤微生物多样性被认为是修复重金属污染土壤过程的敏感指标[31].LISP处理对土壤中微生物群落的丰富度和多样性的影响较小.与Mench等[32]研究发现在轻度Cd污染土壤中施用棕色角闪石和铁砂对细菌丰富度无明显影响的结果一致.然而,在螯合铁肥,复合碳酸钙、钙镁磷肥和含硫有机物,以及复合炉渣和生物炭处理下,土壤微生物群落的多样性和丰度均降低而不利于微生物生长[15,33-34].因此,添加LISP可维持污染土壤中正常微生物群落的多样性和丰富度,对农田土壤的生态安全无明显影响.然而,基于 PCA和 NMDS分析表明LISP可显著影响土壤微生物群落的β-多样性,且不同添加量的影响具有显著差异.有研究表明,土壤中添加石灰、有机肥、螯合铁肥等材料可有效改变土壤中微生物群落的形成[15,35].Pei等[31]也发现海泡石和蚯蚓粪复合调理剂可显著改变污染土壤微生物群落的 β-多样性.因此,添加 LISP可改变土壤微生物群落的组成和结构,而对土壤微生物的丰富度和多样性影响较小.

LISP处理下土壤中厚壁菌门、放线菌门和浮霉菌门等门水平物种的相对丰度增加,而绿弯菌门、酸杆菌门和疣微菌门等门水平物种的相对丰度降低(图 3).兰玉书等[15]研究发现施加钝化剂后导致土壤厚壁菌门相对丰度增加,而绿弯菌门相对丰度降低,与本研究结果一致.酸杆菌门嗜酸,不利于在碱性环境中生存[35-36].添加LISP使土壤pH值增加,且土壤pH值与酸杆菌门呈显著负相关(图5),可能是导致土壤中酸杆菌门相对丰度降低的原因.因此,添加土壤调理剂和种植过程可改变土壤pH值、土壤环境和养分含量,影响土壤中某些微生物的生长和代谢活动,进而影响微生物群落结构[37].有研究表明,施用磷肥可导致放线菌门和浮霉菌门相对丰度增加,而绿弯菌门和疣微菌门相对丰度降低[38].放线菌门和浮霉菌门具有溶磷作用[38],因此可将钙镁磷肥中难利用的无机磷转化为作物可吸收利用的磷形态,进而一定程度提高土壤中有效态磷含量.本研究中 LISP含有钙镁磷肥,可有效提高土壤中有效态磷含量,一定程度影响土壤微生物群落的组成.

在0.4%LISP处理下,节杆菌属、虚构芽胞杆菌属、慢生根瘤菌属、Defluviicoccus、Singulisphaera、类芽孢杆菌等微生物的相对丰度较对照升高,而地杆菌属、厌氧粘细菌、马赛菌属等微生物的相对丰度较对照明显降低.其中地杆菌属、厌氧粘细菌等属于铁还原菌[39],其相对丰度下降的原因可能是由于施加LISP中的铁粉属于还原铁粉,在土壤中通过氧化反应生产Fe2+和Fe3+,从而影响土壤中铁还原菌的生长和繁殖.马赛菌属易受土壤 pH 值影响[40],本研究中添加LISP可显著改变土壤pH值而影响马赛菌属的相对丰度.节杆菌属、Singulisphaera、类芽孢杆菌和Defluviicoccus具有溶磷作用[38,41-43],表明LISP中的钙镁磷肥可能会促进溶磷细菌的生长,且溶磷细菌分泌有机和无机酸性等物质可提高土壤中磷的有效性.虚构芽胞杆菌属于固氮菌,可显著影响水稻苗期对Cd的吸收[44].慢生根瘤菌属具备固氮作用,对 As的生物有效性有重要影响[45].研究结果表明,LISP有利于土壤节杆菌属、Singulisphaera、Fictibacillus、慢生根瘤菌属等微生物的生长和繁殖,在调节土壤物理化学性质和钝化Cd和As等方面发挥重要的作用.

一般而言,土壤中重金属有效性与微生物群落结构呈现负相关[13,46].本研究中,添加LISP可有效降低土壤Cd和As的生物有效性,来缓解重金属对土壤微生物群落结构的不利影响.研究表明,土壤稳定化修复过程中,土壤pH值和重金属有效性可有效影响重金属污染土壤细菌群落结构[47],而土壤pH值是影响微生物群落的关键因素[15,35,46].本研究中,添加LISP可提高土壤有效磷和 pH 值(表 2),表明添加LISP主要通过改变土壤有效磷和pH值来调控土壤微生物群落结构.土壤微生物结构对环境变化较为敏感[31],且土壤物理化学性质的变化在调节微生物对重金属的适应过程中起着重要作用[48].因此,添加LISP可提高土壤有效磷和pH值,降低土壤As和Cd的生物有效性,进而调节土壤微生物对重金属污染环境的适应性.

4 结论

4.1 添加LISP可显著改变农田土壤的基本理化性质,降低土壤Cd和As的有效性,且对土壤微生物α—多样性无明显影响,但显著改变土壤 β—多样性.与CK相比,在0.4%的LISP处理下土壤pH值、土壤有效磷和总磷含量分别显著(P＜0.05)提高 0.57单位、130.6%和18.38%,同时土壤有效态Cd和As含量分别显著(P＜0.05)降低21.76%和16.39%.

4.2 高通量测序结果表明,LISP处理下土壤中厚壁菌门、放线菌门和浮霉菌门等门水平物种的相对丰度增加,尤其是有利于土壤中节杆菌属、Singulisphaera、Fictibacillus、慢生根瘤菌属等益生微生物的生长和繁殖.LISP可显著改变土壤微生物群落的组成和结构,其中土壤pH值和有效磷的增加,以及土壤有效态As和Cd含量的降低是调控土壤微生物群落的主要环境因子.因此,多元复合调理剂LISP可提高土壤pH值和磷含量,同时降低Cd和As的生物有效性,对农田土壤的生态安全无明显影响.