气相分子吸收光谱法测定渔业水质中氨氮含量方法的建立

金慧，赵城，魏琳婷，郑光明，尹怡

(中国水产科学研究院珠江水产研究所/农业农村部水产品质量安全风险评估实验室(广州)/农业农村部休闲渔业重点实验室/广东省水产动物免疫技术重点实验室，广东 广州 510380)

常见的氨氮检测方法有纳氏试剂分光光度法[8-9]、连续流动-水杨酸分光光度法[10-11]、蒸馏-中和滴定法[12-13]、气相分子吸收光谱法[14-15]等。其中纳氏试剂分光光度法中纳氏试剂含有汞，会危害实验人员健康；连续流动-水杨酸分光光度法能实现自动化检测，但是对样品的洁净程度要求较高，对于较浑浊的渔业水质不能直接测定，需经过蒸馏等前处理步骤；蒸馏-中和滴定法的样品需经过预蒸馏，无法实现自动化检测，不利于大批量样品的测定。气相分子吸收光谱法由Gresser等[16]在1976年研发，1982年用于氨氮的自动测定[17]，并于2000年实现仪器国产化[18]。目前国内该仪器生产技术较为成熟，检测方法简单、成本低、分析时间快(单个样品2～3 min)、自动化程度高、测定准确[19-21]。该方法是将氨氮置于酸性介质中，用次溴酸盐将氨氮氧化成等量亚硝酸盐，通过乙醇催化产生NO2气体，最终测定NO2的含量。由于该方法是测定转化的气体，因此水样色度、悬浮物等干扰物对其影响基本可以忽略。

在实际检测过程中发现，水样中的氨氮不稳定，容易受到温度、pH等因素影响。因此，需要优化贮运条件来确保氨氮含量稳定。在生活饮用水、地表水和环境水样等领域，该方法的样品前处理常常被忽视，少部分研究人员直接采用SC/T 9102.1—2007、SC/T 9102.2—2007和SC/T 9102.3—2007的标准执行[22-25]，这些标准虽然详细规定了样品采集的工具和方法，但对样品的保存和运输条件规定不具体。因此，本研究优化了样品pH、运输条件、贮存温度、贮存时间和样品均匀性等贮运条件以及样品前处理条件，建立了气相分子吸收光谱仪测定渔业水质中氨氮的方法。同时，采用该方法对采集的渔业水源、养殖淡水和海水进行了风险评估。本研究旨在获得简单具体的样品贮运条件，优化样品前处理步骤，建立一种简单、快速、准确、灵敏度高及可批量检测的气相分子吸收光谱法测定渔业水质中氨氮含量方法，为渔业水质中氨氮的快速检测、水产养殖过程中水质实时风险监控及渔业水生态保护提供重要的技术基础。

1 材料与方法

1.1 仪器

AJ-3700气相分子吸收光谱仪(上海安杰环保科技股份有限公司)，配有自动进样器和自动稀释功能；AL204分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司(上海))；超纯水机(美国Millipore公司)。

1.2 试剂

1 000 μg/mL氨氮标准溶液(GSB 04-2832-2011)购自国家有色金属及电子材料分析测试中心；水质氨氮环境标准样品(批号：2005120、2005122)购自环境保护部标准样品研究所；浓盐酸为优级纯(广州化学试剂厂)；浓硫酸以及无水乙醇为分析纯(广州化学试剂厂)；溴酸钾、溴化钾以及氢氧化钠均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)；实验用水为25 ℃，电阻率>10 MΩ·cm的无氨水。

6 mol/L盐酸：将500 mL浓盐酸缓慢倒入装有500 mL水的1 L大烧杯中，搅拌均匀，恢复至室温待用。

载流液：向1 L大烧杯中依次加入500 mL 6 mol/L的盐酸，无水乙醇150 mL，水350 mL充分摇匀，静止至常温无气泡，敞口放置1d后使用。

400 g/L氢氧化钠溶液：称取80.0 g氢氧化钠于500 mL烧杯中，加入190 mL水，迅速搅拌溶解，待恢复至室温，用胶头滴管定容至200 mL，于聚乙烯瓶中密封保存，24 h后待用。

溴酸盐混合液：称取2.81 g溴酸钾及30.00 g溴化钾，加水溶解，定容至500 mL棕色容量瓶中待用，0～4 ℃避光条件下贮藏，可保存90 d。

氨氮氧化剂：在1 L棕色玻璃瓶中依次加入400 mL水，12 mL溴酸盐混合液，24 mL 6 mol/L盐酸，于暗处静置5 min，加入200 mL 400 g/L氢氧化钠溶液，充分摇匀，待小气泡逸尽再使用。注意溶液在18～28 ℃温度下配制，现配现用。

氨氮标准使用液：准确移取氨氮标准溶液 1.00 mL，定容至500 mL，获得浓度为2.00 mg/L的氨氮标准使用液，现配现用。

1.3 仪器参数

氘灯电流：50.00 mA；测定波长：213.90 nm；载气流量：0.197 L/min；载气：空气；加热系统：87.5 ℃；制冷系统：1.8 ℃；样品泵速：80 r/min；试剂泵速：45 r/min；氧化泵速：35 r/min。

1.4 样品采集与保存

按照SC/T 9102.1—2007[26]、SC/T 9102.2—2007[27]和SC/T 9102.3—2007[28]规定的方法取多份水产养殖水样。水样采集于聚乙烯瓶或玻璃瓶中，并充满样品瓶。水样采集后加硫酸调节pH为1～3，采样运输时间小于6 h可常温贮运，置于4 ℃冷藏可保存10 d。

1.5 方法优化

1.5.1 氨氮样品pH

采集2 L水产养殖用水平均分装在4个500 mL棕色磨口玻璃瓶中，取其中1瓶快速测定氨氮初始含量。随后对另外3个样品加入1 mol/L稀硫酸调节水样的pH分别为1、2和3，于4 ℃避光条件下保存，连续测定10 d，每次测定设置3个平行并取平均值，绘制不同pH对样品的氨氮含量影响图。

1.5.2 运输温度

将现场采集并经酸固定的样品置于常温环境(24±5)℃中模拟运输状态，每2 h测定氨氮浓度一次，连续测定16 h。以氨氮浓度为纵坐标，运输时间为横坐标，绘制常温状态下16 h内样品中氨氮含量变化图。

1.5.3 贮存温度

将现场采集并经酸固定的样品分装在2个500 mL棕色磨口玻璃瓶中，分别置于4 ℃和常温(24±5)℃2种条件下贮存10 d，连续10 d测定水样的氨氮含量变化，绘制样品在常温与冷藏状态下10 d内的氨氮含量变化图。

1.5.4 水样均匀性

以4 ℃密封冷藏1 d的水样为研究对象，分别用5 mL胶头滴管小心吸取下层液和上层液各40 mL，然后摇匀样品取摇匀液40 mL，测定其氨氮含量，用t-检验比较之间的差异。

1.5.5 过滤

过滤是一种简单高效的基质除杂方法。其滤纸按材料可分为棉质纤维滤纸、玻璃微纤维滤纸以及其他滤纸。棉质纤维滤纸一般分为定性滤纸、定量滤纸及层析定性分析滤纸[29]。考虑到层析定性滤纸主要用于色谱分析，本研究选择玻璃微纤维滤纸、定性滤纸以及定量滤纸3种不同品牌的滤纸测定过滤对氨氮测定的影响。选用多个品牌的12种滤纸(6种定性滤纸、5种定量滤纸以及1种玻璃微纤维滤纸)，每种滤纸随机抽取3张，对1 mg/L氨氮标样过滤后进行测定，重复3次。

1.6 标准曲线绘制与样品测定

1.6.1 标准曲线的绘制

将氨氮标准溶液放置于自动进样器的进样盘上，设置好仪器参数，启动测试。自动进样器吸取氨氮标准溶液和实验用水，自动稀释各标准浓度溶液：0、0.10、0.20、0.50、1.00和2.00 mg/L，泵入气相分子吸收光谱仪测定吸光度，以吸光度为纵坐标，对应的氨氮浓度为横坐标，绘制出标准曲线。

1.6.2 样品测定

移取45 mL摇匀的样品至50 mL样品管中，按照绘制标准曲线相同的步骤，进行样品的测定。若试样中氨氮含量超出标准曲线检测范围，稀释样品后重新测定。

1.7 检出限与测定下限

按照样品分析的全部步骤，配制0.03 mg/L低浓度氨氮样品重复测定8次，将各测定结果换算为样品中的浓度，计算8次平行测定的标准偏差，按HJ 168—2010《环境监测 分析方法标准制修订技术导则》[30]计算方法检出限，测定下限为4倍检出限。置信度为99%时的t值为2.998。

MDL=t(n-1,0.99)×S

式(1)

式中：MDL ——方法检出限；n——样品的平行测定次数；t——自由度为n-1，置信度为99%时的t分布(单侧)；S——n次平行测定的标准偏差。

2 结果与讨论

2.1 样品pH对氨氮测定的影响

现场采集水样后，为保证样品的稳定，通常在水样中加硫酸调节pH小于2[27-28]。pH计能准确测定水样的pH，但不方便携带。pH试纸方便携带，但检测精度较低。为评估现场采样时是否可使用pH试纸进行替代，加酸调节水样的pH，探究在4 ℃避光条件下，不同pH对实际样品氨氮检测结果的影响，结果如图1。连续10 d pH为1、2和3的样品中氨氮平均含量分别为0.46、0.47和0.47 mg/L，相对标准偏差范围为 0.4%～0.8%。结果表明水样在pH为1～3之间时，氨氮结果无显著相关性。因此，在现场采样加酸测定时，水样pH在1～3范围内均可，无需精确调节pH，可使用pH试纸进行测定。

图1 不同pH对样品的氨氮含量影响Fig.1 Influences of different pH values on ammonia nitrogen content of samples

2.2 样品运输过程对氨氮测定的影响

将样品置于常温环境(24±5)℃中模拟运输状态，探究常温状态下16 h内样品氨氮含量变化。由图2可知，常温样中氨氮含量变化整体上呈现先下降后趋于稳定的趋势。16 h氨氮含量的总波动范围为：3.04～3.34 mg/L，前6 h内氨氮含量的波动范围为：3.21～3.34 mg/L，波动小，而6 h后的波动范围为：3.04～3.21 mg/L，波动相对较大且均分布在0 h氨氮测定值下方呈现缓慢下降趋势。说明氨氮样品常温运输6小时以内，样品氨氮测定准确度较高。常温样品氨氮含量变化的原因可能是样品加酸后，大部分微生物快速死亡，只有少量耐酸性硝化细菌存活，并利用水溶氧分解氨氮，使氨氮含量下降[31-32]；随着耐酸性硝化细菌繁殖速率的降低，同时因代谢物积累产生负反馈调节且抑制了其生长，氨氮含量逐渐趋于平稳。因此，长时间常温运输会影响样品中的氨氮含量，当运输时间超过6 h时，使用冷藏运输(0～4 ℃)来稳定氨氮含量，可提高氨氮测量准确性。

图2 模拟常温运输水样中氨氮含量变化Fig.2 Changes in ammonia nitrogen content of water samples in the simulated state of room temperature transportion

2.3 样品贮存温度对氨氮测定的影响

比较了冷藏4 ℃和常温(24±5)℃两种贮存条件下，10 d内水样的氨氮含量变化。由图3可知，10 d内常温样和冷藏样标准偏差分别为4%和1%，即冷藏样相对比较稳定。常温样氨氮含量整体呈上升趋势，而冷藏样氨氮含量相对稳定。常温下渔业水质中氨氮浓度下降原因可能是样品中微生物活性高，一开始溶氧量高，好氧性硝化细菌分解氨氮产生硝酸盐与亚硝酸盐，导致氨氮含量降低[33]；之后氨氮浓度上升，原因可能是随着氧气浓度下降，反硝化细菌等微生物利用含氮有机物合成氨氮，导致氨氮含量升高[34]，当样品中氧气耗尽后，反硝化细菌生长更为迅速，样品中的氨氮呈现不断上升状态，直到含氮有机物消耗完。而在冷藏时，低温抑制了硝化细菌和反硝化细菌对氨氮的活性作用，所以水样中的氨氮含量相对稳定。因此建议对样品进行冷藏贮存，在4 ℃下可以保存10 d。

图3 样品在常温与冷藏状态下10 d内的氨氮含量变化Fig.3 Changes of ammonia nitrogen content of water samples in 10 days at room temperature and refrigeration

2.4 水样均匀性对氨氮测定的影响

取4 ℃冷藏1 d的水样下层液、上层液及摇匀液，分别测定其氨氮含量，探究水样均匀性对氨氮测定的影响。结果发现：上层液、下层液以及摇匀液的氨氮含量平均值分别为：7.99、10.50和9.39 mg/L，相对标准偏差分别为0.01%、0.50%以及0.77%。对上层液、下层液分别与摇匀液进行t-检验，发现上层液与摇匀液氨氮含量差异显著(P<0.01)，下层液与摇匀液氨氮含量也差异显著(P<0.01)。原因是低温静置导致吸附有氨氮的杂质(如悬浮物、生物絮团)发生物理性沉降，使得样品中氨氮不均一。因此测定水样前，需对样品进行充分摇匀，以确保样品的均匀性。

2.5 过滤对氨氮测定的影响

在分析测定时，减少样品基质含量通常可以提高检测的灵敏度与准确度。对于水样，过滤是一种简单、高效及易操作的去除基质的方法。选用多个品牌的12种滤纸(6种定性滤纸、5种定量滤纸以及1种玻璃微纤维滤纸)进行过滤实验，探究过滤对氨氮测定的影响，结果见表1。5种定量滤纸过滤标样前后的氨氮含量的相对误差范围为-79%～-5%，说明定量滤纸对氨氮存在一定的吸附作用，与滤纸品牌及速率无直接关系。6种不同型号的定性滤纸过滤标样前后的氨氮含量的相对误差范围为-67%～18%，说明定性滤纸对氨氮有的存在吸附作用，有的存在释放氨氮作用，与速率无直接关系。而使用玻璃微纤维滤纸过滤后发现未测出氨氮含量，说明玻璃微纤维滤纸对氨氮存在较强吸附能力。鉴于气相分子吸收光谱是通过将样品气化后检测的[35]，对于无大颗粒的复杂水样也能准确测定，因此不建议进行过滤操作，可直接测定。

表1 12种滤纸过滤1 mg/L氨氮标样后的氨氮含量Tab.1 Ammonia nitrogen content after filtering 1 mg/L standard sample with 12 kinds of filter paper n=3

2.6 方法的线性范围与检出限

2.6.1 方法的线性关系与线性范围

采用自动稀释法配制浓度分别为0、0.10、0.20、0.50、1.00和2.00 mg/L的标准溶液。以吸光度为纵坐标，质量浓度为横坐标，建立标准曲线(如图4)。氨氮在0.1～2.0 mg/L范围内的相关系数r>0.999 9，曲线方程为：y=0.221 242x+0.002 250。结果表明该方法线性良好。

图4 氨氮标准曲线图Fig.4 Ammonia nitrogen standard curve

2.6.2 检出限与测定下限

对配制0.03 mg/L的氨氮样品连续测定8次的结果计算得出方法检出限MDL为0.003 3 mg/L，测定下限为0.013 mg/L。

2.7 方法的准确度和重现性

2.7.1 水质氨氮环境标准样品的检测

对氨氮含量分别为(1.49±0.06)mg/L以及(2.02±0.12)mg/L的水质氨氮环境标准样品(批号分别为2005120、2015122)进行测定，连续测定6次，测得平均值分别为(1.49±0.02)mg/L和(1.99±0.01)mg/L，相对误差分别为0和1.49%，结果表明该方法准确度高、重现性好。

2.7.2 实际样品的检测

采集淡水和海水样品，在本实验室和其他实验室同时进行检测及加标回收实验，结果如表2。淡水和海水在两实验室的相对偏差为3.6%和7.4%，两实验室对不同基质的水样测定的回收率范围为90%～105%，相对标准偏差范围为0.36%～3.26%，说明该方法的重现性良好。因此，该方法可用于渔业水质中氨氮的测定，满足实际检测的需求。

表2 渔业水质淡水和海水3个浓度水平的回收率和重现性Tab.2 Recovery and reproducibility of fresh water and sea water at three concentration levels n=6

2.8 实际样品测定及风险评估

采用本方法对随机采集的渔业水源水、淡水以及海水进行测定，结果发现其氨氮浓度分别为：3.23、0.57 和1.77 mg/L。渔业水质标准中规定渔业水质中氨氮的浓度不得超过0.02 mg/L，随机采集的几种渔业水质均存在不同程度的氨氮含量超标。因此，作为渔业水质的重要指标，在水产养殖中建议重点关注并做好风险监控。

3 结论

本研究对氨氮样品pH、运输温度、贮存温度、贮存时间等贮藏条件和样品前处理步骤进行了优化，建立了气相分子吸收光谱仪测定渔业水质中氨氮的方法。样品采集于棕色磨砂玻璃瓶中，调节pH为1～3，6 h内可常温运输，水样4 ℃冷藏10 d测定仍准确有效。样品经摇匀后，直接使用气相分子吸收光谱仪测定，外标法定量。该方法优化了从采样、送样、存样及制样到上机测定整个渔业水质氨氮采集测定过程，没有使用氯化汞、三氯甲烷等危害人体健康的杀菌剂，减小了样品中的氨氮含量波动，提高了测定的准确性。同时，该方法简单高效、准确度高、重复性好，可在不同地域实验室或检测机构推广用于渔业水质测定。利用该方法对随机采集的渔业水源水、养殖淡水以及海水进行测定，样品平均浓度分别为：3.23、0.57及1.77 mg/L，均超过了渔业相关标准规定的0.02 mg/L，因此，作为渔业水质的关键指标，建议在渔业养殖中做好氨氮的风险监控及渔业水生态保护。