饲料中淀粉含量测定方法的对比研究

王建伟

（甘肃省畜牧技术推广总站，甘肃 兰州 730030）

淀粉以颗粒物的形式存在于谷物、块茎中，是由D-葡萄糖组成的一种多糖，在饲料营养分析中需要经常测定。因此，在生产实践中找到操作简便快捷、测定结果准确的方法十分必要。当前，国际上最准确的淀粉测定方法由瑞典人J.Holm提出，待测定样品先后经过热稳定性α-淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、葡萄糖氧化酶处理，然后用分光光度计比色测定。该方法具有快速、准确的优点，缺点是以上3种酶制剂批次不同，质量规格差异较大，且价格昂贵，测定成本较高，在常规饲料营养分析中不适用。AOAC淀粉酶分解法，即利用耐高温α-淀粉酶，用乙酸缓冲液进行处理，再进行酸水解比色，是一种常用的淀粉测定方法，具有操作简便、成本低的优点，常用于实验室分析测定，但待测样品中纤维素含量较高时，该方法测定结果的可靠性和准确性有待进一步考证。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 主要试剂 α-淀粉酶（Sigma，A-3403，From Bacillus licheniformis）；淀粉葡萄糖苷酶（Sigma，A-3042，From Aspergillus niger）；葡萄糖氧化酶（Sigma，G-6641，From Aspergillus niger）；过氧化物酶（Sigma，P-8125，From Horseradish）；二甲基亚砜（分析纯）。

1.1.2 器械 植物粉碎机、台式离心机、水浴锅、涡旋器、酸度计（JKY/PH112/M315900）、分光光度计（CN61M/SP-752）、一次性吸管、容量瓶、烧杯、铝箔纸、磁力搅拌器。

1.2 试验方法

全价料、青贮玉米、全绒棉籽、豆粕、麦草、苜蓿、全混合日粮等7种常见饲料的原料经风干并用高速粉碎机粉碎、过筛（1 mm）后作为试样备用。

1.2.1 HW方法 淀粉在淀粉葡萄糖苷酶催化下，最终水解为葡萄糖，再在有氧条件下经葡萄糖氧化酶催化，β-D-葡萄糖氧化，生成D-葡萄糖酸，在505 nm波长处测其吸光度，计算饲料中淀粉的含量。

1.2.1.1 操作步骤。第一步，准确称取190～200 mg试样于50 ml烧杯。第二步，在烧杯中加入5 ml水，置于磁力搅拌器上搅拌混匀，再加入15 ml水进行搅拌。第三步，加入0.1 mlα-淀粉酶，置于磁力搅拌器上混匀。第四步，用铝箔密封烧杯，在强制通风烘箱中烘1 h，92℃，烘后冷却0.5 h。第五步，将玻璃棉放在漏斗中，将样品过滤入100 ml容量瓶，用水冲洗烧杯和漏斗，将样品全数洗入容量瓶中，稀释到刻度，盖好瓶塞，反复倒转混匀。第六步，用1 ml移液管将样品移入50 ml容量瓶中，加入0.1 M醋酸缓冲液（pH 4.5）和淀粉葡萄糖苷酶，振荡摇匀。第七步，用铝箔密封容量瓶，放入强制通风烘箱中烘0.5 h，60℃，每10 min振荡容量瓶以混匀。第八步，冷却0.5 h，然后加水稀释至刻度，盖好瓶塞，反复倒转混匀。第九步，各取1 ml样品溶液和葡萄糖标准液（0.1 g/ml）用移液管移入16×150 mm的试管中；取2管样品，用移液管加入5 ml葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶提取物，混匀、静置，同时用保鲜膜盖好，避免污染。第十步，35℃水浴45 min，暗处冷却10 min。读取505 nm处的吸光值。将分光光度计归0，计算每个样品的平均吸光光度值。

1.2.1.2 计算公式。总淀粉+麦芽糖=(A×S+I)×V×DF×1/1 000 000×W×DM×162/180。式中，A为反应试剂的吸光度减去空白的吸光度，S为斜率，I为标准曲线的截距转换为葡萄糖模型的吸光值，V为样品溶液最后体积，DF为稀释倍数。

1.2.2 AOAC方法 样品中的淀粉利用耐高温α-淀粉酶水解为麦芽糖。利用高纯度的淀粉葡萄糖苷酶通过调节温度和pH值使寡聚糖定量的水解为葡萄糖。葡萄糖的含量取决于高纯度的葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶试剂。如果产物包括支链淀粉或抗性淀粉，则在测定前用二甲基亚砜处理，再用淀粉酶处理[1,2]。

1.2.2.1 试验步骤。第一步，称取试样0.18～0.2 g置于20 ml试管中。第二步，加入0.4 ml浓度为80%的乙醇稀释液，振荡混匀，使试样充分溶解于乙醇中，再加入6.0 ml耐高温α-淀粉酶，充分振荡，使其混匀。第三步，马上置于沸水中水浴6 min，期间每隔2 min晃动1次，使其受热均匀。第四步，将试管放置于50℃水浴锅中5 min，同时加入0.2 mol/L乙酸缓冲液8 ml和淀粉葡萄糖液0.2 ml，振荡混匀，在50℃水浴锅中静置30 min。第五步，加纯水5.6 ml，然后转移至20 ml离心管，将离心机调至3 000 rpm，离心10 min。取上清液1 ml，用10 ml容量瓶加水定容。第六步，各取1 ml样品和葡萄糖标准液移入试管。随机抽取2管样品，用移液管将3.0 ml葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶混合物分别加入样品管中，混匀，静置于50℃水浴锅中20 min。第七步，用标准液将分光光度计归0，取出试管后放置在避光处冷却10 min。用分光光度计测定吸光值，读取505 nm处的吸光值。然后计算每个样品的平均吸光光度值。

1.2.2.2 计算公式。总淀粉+麦芽糖=A×F×1 000×1/1 000×100/W×162/180=A×F/W×90。式中，A为反应试剂的吸光度减去空白的吸光度，F为稀释倍数，W为样品重量，162/180为淀粉中游离葡萄糖转换为葡萄糖苷的系数。

1.3 数据处理

本试验采用配对试验设计，试验数据用SAS8.2 MEANS过程统计分析，检验2种淀粉测定方法结果的差异显著性。

2 结果

2.1 2种方法测定淀粉含量的结果

2种方法测定淀粉含量的结果见表1，其中全价料、青贮玉米、全绒棉籽和豆粕这4种饲料的2种测定结果相近，麦草、苜蓿和全混合日粮的2种测定结果相差较大。

2.2 2种方法测定结果比较

本试验采用配对试验设计，试验数据用SAS8.2 MEANS过程统计分析，表2结果表明P=0.33，即HW法和AOAC法的测定结果差异不显著。

表1 饲料中淀粉含量的测定结果

表2 HW法和AOAC法的比较

3 讨论

HW法和AOAC法均采用淀粉酶分析法，淀粉酶分析法中的酶具有高度专一性，对高分子糖类物质和纤维素无催化分解作用，因此检测饲料淀粉含量准确可靠。但由于淀粉酶分析法中所用的主要酶制剂价格昂贵、规格不同，所以我国一般不用于饲料中淀粉含量的测定，大多用于食品中淀粉含量的测定。

淀粉分子和其他多糖分子一样，易受温度和酶活性的影响。若酶的活性不够，则糖苷键只轻度水解，即变稀。因此，淀粉酶分析法测定饲料淀粉含量时，要严格把控酶的用量及水解时间和温度，且由于同种饲料的不同部分淀粉含量差异较大，采用淀粉酶分析法时应对同一种饲料样品充分混匀并进行平行测定，使试验数据更具代表性[3,4]。

HW法和AOAC法的测定结果差异并不显著，说明HW法和AOAC法对饲料淀粉含量的测定差异不大。在试验中HW法相比于AOAC法前处理时间长，而且测定步骤多，繁琐的步骤更容易造成测定误差。AOAC法处理淀粉葡萄糖苷酶和葡萄糖标准液使用了相同的温度，节约了实验室资源，且前处理时间短、操作简便，更适用于饲料淀粉的批量检测。