[噻唑基－2－14C]－毒氟磷在产蛋鸡体内的分布

骆沛文 张素芬 张晗雪 胡 成 余志扬 李秦衎柴立红 叶庆富

(1浙江大学原子核农业科学研究所/农业农村部和浙江省核农学重点实验室，浙江 杭州 310058；2 上海启甄环境科技有限公司，上海 201403)

毒氟磷(Dufulin，N－[2－(4－甲基苯并噻唑基)]－2－氨基－2－氟代苯基－O，O－二乙基膦酸酯)是贵州大学自主创制的新型植物抗病毒剂，对烟草、黄瓜、番茄、水稻病毒病具有良好的防治效果[1－3]。毒氟磷通过触发烟草水杨酸信号传导通路诱导作物的抗病毒能力，还可以干扰病毒的蛋白表达[4－6]，且施用毒氟磷对作物生长有促进作用[7]。此外，毒氟磷具有低毒的特点，对蜂、鸟等环境生物均不构成危害[8]，有良好的应用前景。

近些年，针对毒氟磷环境行为的研究逐步开展，Zhu 等[9]、Zhang 等[10]及郑坤明等[11]分别研究了毒氟磷在不同作物－土壤体系中的残留消解规律。Shi等[12]研究了毒氟磷手性异构体在玉米中的降解动态；Zheng 等[13]发现在西瓜露地条件下(R)－毒氟磷比(S)－毒氟磷消解相对更快；Al-shaalan 等[14]研究了毒氟磷在水－沉积物体系中的手性选择性降解。Wang等[15]推测毒氟磷在土壤中会发生降解，苄基与氨基相连的C-N 键断裂形成2－氨基－4－甲基苯并噻唑。值得关注的是，农药施用后会在农作物中残留，通过食物链的传递在动物体内富集，一方面会危害动物健康，影响产能，另一方面会造成动物源食品安全问题，从而威胁到人类健康[16－17]，在我国不同地区及其他国家都曾发现动物源食品农药污染的情况[18－21]。美国环境保护局(United States Environmental Protection Agency，EPA)、经济合作与发展组织(Organization for Economic Co-operation and Development，OECD)等规定，在农药登记时必须提供拟登记农药在禽畜中残留分布与代谢的研究资料。Chen 等[22]研究了不同构型的毒氟磷母体在大鼠体内的残留分布，结果表明，不同剂量下毒氟磷母体在大鼠血液中均呈先上升后下降的变化趋势，(R)－和(S)－毒氟磷在血液中的半减期相似但明显低于其外消旋体的半减期；毒氟磷在组织中的残留主要分布在肝脏中。然而，有关毒氟磷在畜禽中分布代谢相关研究鲜见报道，尚不明确其在畜禽中的残留分布特征及代谢规律。因此，研究毒氟磷在家禽体内的残留分布特征对全面评价其安全性具有重要意义。

本研究采用14C 示踪方法，通过口服灌胃的方式单剂量连续多次给药，将[噻唑基－2－14C]－毒氟磷引入产蛋鸡体内，研究其在产蛋鸡体内的吸收分布特征与排泄规律，旨在为全面、科学评价毒氟磷在家禽中的安全性提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 标记化合物[噻唑基－2－14C]－毒氟磷和[苄基－14C]－毒氟磷由浙江大学和上海启甄环境科技有限公司共同合成[23－24]。标记化合物的质量指标分别通过高效液相色谱－质谱联用技术(high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS)、高效液相色谱－液闪测量联用技术(high performance liquid chromatography-liguid scintillation counting，HPLC-LSC)、 高效液相色谱紫外检测法(high performance liquid chromatography-ultraviolet，HPLCUV)测得:比活度分别为20.45 和19.91 mCi·mmol－1；放射性化学纯度均大于97%；化学纯度均大于99%；质荷比m/z 为409.115(ESI＋)。2 种标记化合物结构式如图1 所示。

图1 [噻唑基－2－14C]－毒氟磷(a)和[苄基－14C]－毒氟磷(b)结构式Fig.1 Structure of [thiazyl－2－14C]－Dufulin(a) and[benzyl－14C]－Dufulin(b)

1.1.2 试验动物 大羽白肉鸡(Gallus gallus domesticus，以下简称“白羽鸡”)，购于上海玉章禽蛋专业合作社，均处于25～40 周龄，即处于稳定产蛋期。喂养饲料为市售产蛋鸡配合饲料，购自石家庄正大有限公司；口服灌胃液溶剂为市售金龙鱼非转基因葵花籽油。

1.1.3 试剂 甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二甲苯、乙二醇乙醚，均为分析纯，购自北京国药集团化学试剂有限公司；乙腈、甲醇、闪烁纯试剂:2，5－二苯基恶唑(PPO)、1，4－双[2－(5－苯基恶唑)](POPOP)，均为色谱纯，购自上海TCL 公司。闪烁液A、闪烁液B(碱性闪烁液)自配。

1.2 试验设计

1.2.1 口服灌胃液配制 根据OECD《畜禽中农药代谢试验准则》中的建议，家禽代谢试验的给药量不低于10 mg·kg－1diet。本 试 验 设 计 的 给 药 量 按10 mg·kg－1diet，每只鸡日食量110 g 计算，即每只鸡每天给药1.1 mg，每只鸡每天放射性标记物引入量为25 μCi，连续7 d 给药累计引入175 μCi。以市售葵花籽油作为溶剂配制灌胃液，具体配制方法如下:

称取15.0±0.1 mg 比活度为20.45 mCi·mmol－1的[噻唑基－2－14C]－毒氟磷，并称取40.0±0.1 mg 化学纯度为99.1%的非放射性毒氟磷原药，用葵花籽油溶解并定容至10 mL 容量瓶，上下颠倒混匀后，转入样品瓶中，获得浓度为1.1 mg·mL－1、比活度为8.73 mmCi·mmol－1的灌胃液。于4℃条件下保存备用。[苄基－14C]－毒氟磷口服灌胃液的配制方法同上。

1.2.2 试验动物培养及给药 试验设置6 个重复，随机选择6 只健康白羽鸡。试验开始前一周，移入代谢笼进行适应饲养，每只鸡单独饲养于一个代谢笼内，试验前禁食12 h，期间自由饮水。试验期间，每日定时定量投喂饲料。

试验采用单剂量多次给药方式。试验开始后，连续7 d，每日同一时间点分别向每只产蛋鸡经口灌服1 mL 1.2.1 中配制的灌胃液。每次给药前后称量给药器械质量，以质量差计算实际给药量。每日给药后将产蛋鸡放回代谢笼，自由饮水进食。最后一次给药6 h 后用乙醚麻醉，然后将6 只产蛋鸡处死解剖。[苄基－14C]－毒氟磷的培养及给药方法同上，也设6 个重复。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 血样采集与处理 第1 天给药后1、3、6、12 h及第2～第6 天每日给药后6、12 h 分别进行1 次翅静脉采血，每次采集约1 mL 于1.5 mL 抗凝离心管；解剖时从心脏采血。然后立即对采集的血样进行分析，剩余样品于4℃冷藏保存。

吸取200 μL 血样于1 mL 离心管，4 000 r·min－1离心10 min，吸取上清液50 μL 于闪烁瓶中，加入10 mL闪烁液A，设置3 个平行，于Tricarb－4910 TR 型液体闪烁测量仪(liquid scintillation counter，LSC)(美国PerkinElmer 公司)测量其放射性。另取50 μL 血样于燃烧船，设置3 个平行，进行氧化燃烧，10 mL 闪烁液B 收集14CO2并用LSC 测量其放射性。

1.3.2 蛋样采集与处理 根据实际情况，每日给药后的12、24 h 进行2 次采集。蛋样采集后称重处理，用开蛋器将蛋壳开口，小心将蛋液倒入蛋液分离器将蛋清和蛋黄分开，分别称重，于－25℃冷冻保存。

分离后的蛋壳粉碎后混匀，称取0.10±0.01 g 于燃烧船，进行氧化燃烧分析，设置3 个平行；蛋清、蛋黄分别涡旋混匀后，称取0.10±0.02 g 于燃烧船，设置3个平行，进行氧化燃烧，10 mL 闪烁液B 收集14CO2并用LSC 测量其放射性。

1.3.3 排泄物样品采集与处理 每日给药后12 和24 h 分别采集一次排泄物，记录鲜重，然后置于－25℃预冻2 h 后，置于－86℃真空冷冻干燥机干燥，干燥时长48 h，冻干后称量记录样品净重。冷冻干燥样品置于－25℃冷冻保存。

冷冻干燥处理后的排泄物样品磨碎混匀，称取0.10±0.01 g 于燃烧船，设置3 个平行，进行氧化燃烧分析，10 mL 闪烁液B 收集14CO2并用LSC 测量其放射性。

将排泄物中累计放射性占累计引入量的比值定义为累计排泄率(cumulative excretion，CE)，根据公式计算每日累计排泄率:

式中，ai为第i天给药后0～24 h 排泄物的放射性活度，Ai为第i天引入的标记化合物放射性活度。

1.3.4 组织样品采集与处理 解剖后采集腿肌、胸肌、翅、心脏、肝脏、肺脏、肾脏、脾脏、胆囊、胃(嗉囊、腺胃、肌胃)、大小肠(包括小肠、十二指肠、大肠)、盲肠、脂肪、卵巢、皮、脑。其中，胃、肠中内容物取出单独保存；胆囊切开后，胆汁转移至50 mL 离心管中保存，剩余部分另装袋保存。以上所有样品称重并记录，于－25℃冷冻保存。

胆汁样品解冻后，涡旋混匀取约0.1 g(称重并记录)于闪烁瓶中，加入10 mL 闪烁液A，设置3 个平行，LSC 测量其放射性。其余样品均质处理，称取0.10±0.01 g 于燃烧船，设置3 个平行，进行氧化燃烧，10 mL闪烁液B 收集14CO2并用LSC 测量其放射性。

1.3.5 膳食风险评估方法 参考国际粮农组织(The Food and Agriculture Organization，FAO)及世界卫生组织(World Health Organization，WHO)对食品中化学品膳食暴露的评估指导准则[25]，以每日膳食暴露量(estimated daily intake，EDI)与农药最大允许日摄入量(acceptable daily intake，ADI)比较作为风险描述，计算安全限值(margin of safety，MOS)进行风险评估。具体计算方式如下:

式中，C 为残留物浓度，Q 为食物品日摄入量，bw为体重。若MOS≤1 则表明待评估残留物对食品安全的风险是可以接受的。

1.4 数据分析

采用SPSS 20.0、Origin 9.0 对试验数据进行统计处理与分析，采用单因素方差分析(One-way analysis of variance，ANOVA)检验差异的显著性(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 [噻唑基－2－14C]－毒氟磷在产蛋鸡体内的物料平衡

口服给药7 d 后，[噻唑基－2－14C]－毒氟磷的物料平衡概况如图2 所示。[噻唑基－2－14C]－毒氟磷总回收率为90.10%。其中，排泄物占主要部分，占引入量的82.24%，其次是组织(3.81%) 和肠内容物(2.90%)，胃内容物(1.15%)最少。根据OECD 动物代谢试验准则，动物体物料平衡试验中，放射性回收率介于90%～110%即符合要求。考虑到实际试验过程中，处置后的笼具存在清洗损失，上述回收率是合理的。

图2 [噻唑基－2－14C]－毒氟磷的放射性回收率Fig.2 The recovery of radioactivity of[thiazyl－2－14C]-Dufulin

2.2 [噻唑基－2－14C]－毒氟磷在产蛋鸡体内排泄率动态变化

[噻唑基－2－14C]－毒氟磷累计排泄率随给药时间变化规律如图3 所示。[噻唑基－2－14C]－毒氟磷进入产蛋鸡体内后，会直接或经过生物转化后随排泄物排出体外。连续给药1～6 d，[噻唑基－2－14C]－毒氟磷累计排泄率总体呈上升趋势，但差异不显著(P>0.05)，最高达到87.04%。由于7 d 给药后6 h 即处置解剖，累计排泄率有所下降。7 d 累计排泄率为82.24%。

图3 [噻唑基－2－14C]－毒氟磷的累计排泄率动态变化Fig.3 The dynamics of cumulative excretion of[thiazyl－2－14C]－Dufulin

1 d 口服给药后0～12 h 及12～24 h 的排泄物放射性活度占1 d 引入量比值如图4 所示。毒氟磷在产蛋鸡体内消除速度快，给药后12 h 内，引入量的63.42%即随粪尿排出体外；12～24 h 内，排泄水平相对变低，排出引入量的18.62%；给药24 h 后累计的排泄率为82.04%。

图4 1 d 给药后[噻唑基－2－14C]－毒氟磷的排泄概况Fig.4 Excretion profiles of [thiazyl－2－14C]－Dufulin after 1 d oral administration

上述结果表明，毒氟磷在产蛋鸡体内的残留物主要通过粪尿排泄出体外消除。因此，有必要进一步关注鸡粪还田后毒氟磷及其代谢产物对环境造成的影响。

2.3 [噻唑基－2－14C]－毒氟磷在产蛋鸡组织中的残留分布

连续给药[噻唑基－2－14C]－毒氟磷7 d，最后一次给药6 h 后对产蛋鸡解剖并检测各组织的放射性活度以阐明其在产蛋鸡组织中的残留分布特征。不同组织中放射性残留分布情况如图5 所示。在蛋、皮、血样、脑、脾、心、卵巢以及肌肉组织如腿肌、翅肌、胸肌中均未检出放射性。上述结果表明，14C－毒氟磷及其14C 代谢物不易在上述组织中形成残留。放射性残留主要集中在胃、胆汁、大小肠、胆囊壁、盲肠、肝中。组织中的残留量均不超过引入量的2.50%；胃中放射性残留相对最高(占引入量的1.36%～2.47%)；肝中的放射性残留占引入量的0.07%～0.11%。毒氟磷不易在肺、肾、脂肪、胰腺中残留蓄积，各组织放射性总残留量均不超过引入量的0.006%。

图5 [噻唑基－2－14C]－毒氟磷在产蛋鸡组织中的残留分布Fig.5 The residual distribution of [thiazyl－2－14C]－Dufulin in laying hen tissues

将14C 残留量按母体的相对分子质量折算可得不同组织中[噻唑基－2－14C]－毒氟磷的残留浓度，如表1 所示。胆(包括胆囊壁、胆汁)残留浓度相对最高，其次是胃、盲肠、大小肠、肝。肺、肾、胰腺、脂肪中放射性残留水平比较低(<0.05 mg·kg－1)。

表1 不同组织中[噻唑基－2－14C]－毒氟磷的残留浓度Table 1 The residual concentration of [thiazyl－2－14C]－Dufulin in different tissues

上述结果中，血样未检出放射性，而肝、胆等组织中检测到放射性残留，可能是由于首关效应[26]，进入全身循环的毒氟磷含量减少，在翅静脉采集的血样中难以检测到放射性。但通过多次给药的累积作用，毒氟磷会在肝脏、胆等代谢、排泄组织中形成残留。

3 讨论

3.1 [噻唑基－2－14C]－毒氟磷在产蛋鸡体内的膳食风险评估

已有研究表明[27－28]，部分含磷有机物农药通过食物链富集在肉类食物中，人类食用后会造成癌症以及免疫系统和激素功能异常等问题。鸡是人类日常食用的肉类食物之一，毒氟磷在其可食用组织中的残留分布特征对毒氟磷安全性评价有重要参考价值。

《GB 2763－2019 食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》[29]规定毒氟磷 ADI 为 0.54 mg·kg－1bw·d－1。根据国家卫健委《中国居民膳食指南(2016)》[30]推荐中国居民畜禽肉摄入量75 g·d－1、蛋及其制品50 g·d－1、动物内脏每次25 g，成人体重以60 kg 计算可得成人膳食产蛋鸡组织中[噻唑基－2－14C]－毒氟磷残留暴露评估结果如表2 所示。

表2 成人膳食产蛋鸡组织中[噻唑基－2－14C]－毒氟磷残留暴露评估Table 2 Adults dietary exposure assessment of[thiazyl－2－14C]-Dufulin in laying hen tissues

由表2 可知，毒氟磷在产蛋鸡组织中的膳食暴露量低，安全限值远低于1。实际禽肉摄入是由不同组织共同组成，且残留物由毒氟磷母体及其代谢产物组成，因此实际毒氟磷暴露量低于表中值。由此可见，在1.1 mg·kg－1diet·d－1的暴露水平下，毒氟磷在产蛋鸡体内的残留不构成膳食风险。

已有研究表明，毒氟磷原药亚慢性经口毒性试验未见脏器明显病理改变[31]，但对其在动物体内代谢产物的结构及毒性尚不明确，后续需对组织残留物的组成做进一步研究，对毒氟磷代谢产物进行结构鉴定，从而对毒氟磷在产蛋鸡体内的残留分布进行全面、客观的安全性评价。

3.2 不同标记位置的14C－毒氟磷在产蛋鸡体内残留分布的比较

[苄基－14C]－毒氟磷在产蛋鸡体内的累计排泄率及不同组织中的残留分布如表3、表4 所示。[苄基－14C]－毒氟磷在产蛋鸡体内累计排泄率的变化趋势与[噻唑基－2－14C]－毒氟磷相同，经方差分析两者在相同时间的累计排泄率无明显差异(P>0.05)。[苄基－14C]－毒氟磷在组织中的残留分布同样主要集中于消化系统中，胃中放射性残留占引入量比相对最高，其次是胆汁、大小肠、胆囊壁、盲肠、肝。2 种标记的14C－毒氟磷在相同组织中的残留量占引入量比均无显著性差异(P>0.05)。

表3 2 种14C－毒氟磷在产蛋鸡体内的累计排泄率Table 3 Cumulative excretion of [thiazyl－2－14C]－Dufulin and [benzyl－14C]－Dufulin in laying hens

表4 2 种14C－毒氟磷在产蛋鸡组织的残留分布Table 4 The residual distribution of [thiazyl－2－14C]－Dufulin and [benzyl－14C]－Dufulin in laying hens tissues

由此可见，[苄基－14C]－毒氟磷与[噻唑基－2－14C]－毒氟磷在产蛋鸡体内的排泄、组织分布特征相同，究其原因是毒氟磷在产蛋鸡体内会通过羟基化反应和葡萄糖醛酸轭合反应形成极性更大的代谢产物，包括苯并噻唑苯环上甲基的邻位或间位羟基化的产物，以及该产物与葡萄糖醛酸形成的轭合物，毒氟磷母体及羟基化毒氟磷的膦酸酯键脱乙基的产物(本实验室另外的未发表试验结果)。上述产物的结构中，噻唑基标记14C 及苄基标记14C 均未丢失，故利用放射性表征两者在产蛋鸡体内的排泄、分布特征时不存在差异是合理的。因此，在仅研究毒氟磷在产蛋鸡体内的残留分布情况而不涉及代谢产物鉴定时，考虑到科研成本只需选择单一位置标记。

4 结论

本研究以产蛋大羽白肉鸡为试验对象，采用14C示踪技术以经口多次给药的方式引入[噻唑基－2－14C]－毒氟磷，研究了毒氟磷在产蛋鸡体内的吸收分布及排泄特征，发现毒氟磷在产蛋鸡体内主要通过排泄物排出体外；毒氟磷在产蛋鸡组织中残留量低，在胃、肠、胆、肝等组织中的残留不超过引入量的2.5%；在蛋、肌肉(腿、胸、翅)、脑、脾、卵巢等组织中未检测到放射性残留。经膳食风险评估，毒氟磷在产蛋鸡体内的残留不会对人体健康构成危害。