响应面法优化柚子酵素的发酵工艺

◎ 刘媛洁

（江西医学高等专科学校，江西 上饶 334000）

柚子（Citrus grandis）是芸香科柑橘属柚树果的果实[1]，在中国主要分布于福建、江西等南方地区[2-3]。柚子含有黄酮类、酚类、多糖类、有机酸、维生素类和微量矿物元素类等多种有益成分[4-6]。柚子果皮和果肉中均含有柚皮苷、橙皮苷、柚皮素等黄酮类化合物，其中柚皮苷含量最高[7-8]。柚子属于药食两用水果，性温，味清香、酸甜，具有理气化痰、散寒燥湿、预防动脉硬化、降血脂、抗氧化等生理和药用功能，且无明显毒副作用[9-11]。

酵素是常以可食性的菌类、果蔬类、植物源类等为原料，经有益菌发酵获得的含有一定生物活性成分的有益食品，其中富含多种生物酶、维生素、氨基酸、酚类、黄酮类、多糖和益生菌等功能成分[12-14]。研究表明酵素中含有的功能成分物质具有灭菌消炎、抗氧化、提高机体免疫能力、修复机体损伤等保健功能[15-18]。

目前，随着现代人们对食品营养的多样性、平衡性、功能性等需求的增加，酵素食品在国内开始风靡，逐渐成为消费者的新宠[19]。柚子皮含有苦味成分柚皮苷[20]，导致全果综合利用度不佳[21]。目前，柚子相关产品的开发与研究主要集中在柚子皮果脯、柚子去皮后制备而成的果酒、饮料等[22-24]，将柚子全果加工成食用酵素的相关研究还未见报道。本文以广丰马家柚为试验原料，选取酵母菌和乳酸菌为菌种进行发酵，以酵素中总黄酮含量为主要指标，研究了一种新型柚子酵素的发酵工艺，获得了适口性好、功能性强的柚子酵素饮品，为柚子的综合利用及工业生产提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

柚子（马家柚），产自江西广丰；红糖，广西农垦糖业集团有限公司；酵母菌、乳酸菌，安琪酵母股份有限公司；芦丁标准品，北京振翔科技有限公司。

恒温培养箱，深圳市澳德玛电子科技有限公司；超净工作台，苏州净化设备有限公司；灭菌锅，上海三申医疗器材厂；722S型可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；冷冻离心机，美国Sigma公司；pH计，济南光耀医疗设备有限公司；分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程

称取一定量的柚子全果，清洗后将柚子皮和柚子果肉切成4 cm3的小块。控制红糖添加量为50%，将部分红糖放入发酵罐的底部，再将处理好的柚子皮和果肉块放入其中，最后用剩下的红糖覆盖原料。酵母菌（活菌数为1×106CFU·mL-1）∶乳杆菌（活菌数为1×107CFU·mL-1）为2∶3（体积比）混合制备混合 菌种，在接种量为2%、发酵温度为30 ℃的条件下密闭发酵84 d。柚子发酵液经滤布初过滤和板块过滤后为柚子酵素原液。

1.2.2 单因素试验设计

（1）菌种体积比。按照50%的红糖添加量进行物料的投放，设定接种比例（酵母菌∶乳杆菌）依次为1∶3、2∶3、1∶1、3∶2和3∶1，接种量为2%，在发酵温度为30 ℃条件下，恒温密闭发酵84 d。发酵结束后以柚子酵素中总黄酮的含量为指标确定最佳接种比例。

（2）接种量。在上述优化菌种体积比的基础上，设定混合菌种的接种量依次为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%，在红糖添加量为50%和发酵温度为 30 ℃条件下，恒温密闭发酵84 d。发酵结束后以柚子酵素中总黄酮的含量为指标确定最佳接种量。

（3）红糖添加量。在上述优化的菌种体积比和菌种接种量的基础上，设定红糖添加量依次为30%、40%、50%、60%和70%，在发酵温度为30 ℃条件下，恒温密闭发酵84 d。发酵结束后以柚子酵素中总黄酮的含量为指标确定最佳红糖添加量。

（4）发酵温度。在上述优化的菌种体积比、菌种接种量和红糖添加量的基础上，设定发酵温度依次为24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃和34 ℃，恒温密闭发酵84 d。发酵结束后以柚子酵素中总黄酮的含量为指标确定最佳发酵温度。

（5）发酵时间。在上述优化的菌种体积比、菌种接种量、红糖添加量和发酵温度的基础上，设定发酵时间依次为4 d、12 d、20 d、28 d、36 d、44 d、52 d、60 d、68 d、76 d和84d。发酵结束后以柚子酵素中总黄酮的含量为指标确定最佳发酵时间。

1.2.3 Box-Behnken试验

自变量因素为红糖添加量（A）、接种量（B）、发酵温度（C）和发酵时间（D），响应值指标为柚子酵素中的总黄酮含量（mg·mL-1），进行Box-Behnken试验。试验设计见表1。

表1 Box-Behnken试验因素与水平设计表

1.2.4 芦丁标准曲线的绘制

参考赵国超等[25]、郑丽等[26]的方法，稍加修改。芦丁标准样品精确称取20 mg于容量瓶中，80%乙醇定容至10 mL，获得芦丁标准溶液（2.0 mg·mL-1）。将不同量的芦丁标准溶液（0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、 2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL）分别置于具塞管中，加入 0.7 mL的5% NaNO2溶液和3.0 mL的80%乙醇； 10 min后加入0.5 mL的14% Al(NO3)3溶液；10 min后加入3.0 mL的4% NaOH溶液；80%乙醇定容至 10.0 mL。在510 nm波长处测定吸光度，获得良好线性关系的回归方程（y=0.806 1x+0.023 5，R2=0.999 6）。

1.3 数据统计与分析

试验重复3次后结果取平均值。利用Excel软件绘制单因素试验结果图；Design-Expert7.0软件进行Box-Behnken试验设计及统计分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 菌种体积比对柚子酵素中总黄酮含量的影响

由图1可知，当酵母菌比例相对较小时，随着酵母菌比例的逐渐增加，总黄酮含量呈现先增加后略降低的趋势。当酵母菌和乳杆菌的菌种体积比为3∶2时，柚子酵素中总黄酮含量达到最大为1.96 mg·mL-1。当菌种体积比超过3∶2后对柚子酵素中总黄酮含量的影响不大。

图1 菌种体积比对柚子酵素中总黄酮含量的影响图

2.1.2 接种量对柚子酵素中总黄酮含量的影响

由图2可知，柚子酵素中总黄酮含量随着菌种接种量的增加呈现先增加后降低的趋势。当接种量达到2%时，柚子酵素中总黄酮含量达到最高值为 2.19 mg·mL-1。因此，选择1.5%～2.5%范围内的接种量进行下一步试验。

图2 接种量对柚子酵素中总黄酮含量的影响图

2.1.3 红糖添加量对柚子酵素中总黄酮含量的影响

由图3可知，柚子酵素中总黄酮的含量随着红糖的添加量呈现先升高后降低的趋势。在40%～60%范围内的红糖添加量对柚子酵素中总黄酮含量的影响较显著，因此选择该范围内的红糖的添加量进行下一步的优化试验。

图3 红糖的添加量对柚子酵素中总黄酮含量的影响图

2.1.4 发酵温度对柚子酵素中总黄酮含量的影响

由图4可知，柚子酵素中总黄酮的含量随着发酵温度的增加而呈现先增加而后逐渐降低的趋势。当发酵温度在30 ℃时，柚子酵素中的总黄酮含量达到最高值。当发酵温度在28～32 ℃范围内对柚子酵素中的总黄酮含量影响较显著，因此选择该范围内的发酵温度进行下一步的优化试验。

图4 发酵温度对柚子酵素中总黄酮含量的影响图

2.1.5 发酵时间对柚子酵素中总黄酮含量的影响

由图5可知，柚子酵素中的总黄酮含量随发酵时间的增加呈现先增加后逐渐略减少的趋势。当发酵时间为60 d时，柚子酵素中的总黄酮含量达到最大值为2.26 mg·mL-1。因此，选择在52～68 d的范围内的发酵时间进行下一步的优化试验。

图5 发酵时间对柚子酵素中总黄酮含量的影响图

2.2 Box-Behnken试验结果

响应面试验结果如表2所示。进行统计分析后得到预测模型为

表2 Box-Behnken试验设计及结果表

Y=-37.361 8+0.198 1A+3.893 8B+1.521 9C+0.229 0D- 0.002 7A2-1.065 3B2-0.029 4C2-0.002 2D2+0.01AB+ 0.003 4AC-0.000 5AD-0.007 5BC+0.009 4BD+0.001 4CD，对上述回归方程进行方差分析，结果见表3。

由表3可知，pModel＜0.000 1表示Box-Behnken试验建立的统计模型有高度的显著性。R2Adj为0.968 6， 表明此模型可解释约96.86%的柚子酵素中总黄酮含量的变化；R2为0.984 3，表明建立的回归方程对实验的拟合度较好。由表3可知，A（红糖添加量）、B（接种量）、A2、B2、C2和D2对柚子酵素中总黄酮含量的影响极显著（p＜0.01）；D（发酵时间）和AC（红糖添加量与发酵温度）对柚子酵素中总黄酮含量的影响极显著（p＜0.01）；C（接种量）、AB（红糖添加量与接种量）、AD（红糖添加量与发酵时间）、BC（接种量与发酵温度）、BD（接种量与发酵时间）和CD（发酵温度与发酵时间）对总黄酮含量的影响不显著（p＞0.05）。模型F值的大小与响应值成正相关，F值越大重要性越大[27]。由表3可知，各自变量因素对柚子酵素中总黄酮含量的影响程度为：B（接种量）＞A（红糖添加量）＞D（发酵时间）＞C（发酵温度）。

表3 回归模型的方差分析表

2.3 响应面分析

红糖添加量、接种量、发酵温度和发酵时间交互作用对柚子酵素中总黄酮含量的影响的响应面曲线及等高线见图6。

图6 各因素交互项对柚子酵素中总黄酮含量影响的响应面和等高线图

响应曲面越陡峭表示因素之间的影响程度越大[28]。由图6可知，柚子酵素中总黄酮的含量存在极高值。对柚子酵素中总黄酮含量的回归方程求解，获得最佳的工艺条件参数为红糖添加量54.53%、接种量2.24%、发酵温度30.19 ℃，发酵时间61.13 d。在此条件下，柚子酵素中的总黄酮含量理论上可达2.39 mg·mL-1。

根据试验实际情况修正最佳工艺条件参数为红糖添加量54.0%、接种量2.0%、发酵温度30.0 ℃，发酵时间61 d。在最佳的工艺条件下重复3次平行试验，实际测定柚子酵素中总黄酮的平均含量为 2.36 mg·mL-1，与预测值的相对误差为1.2%，表明该模型具有良好的拟合度。

3 结论

本试验采用Box-Behnken分析方法，以总黄酮含量为指标对柚子酵素的发酵工艺进行优化试验。该方法制备的柚子酵素不但具有天然柚子芳香风味，而且通过发酵工艺去除了柚子中天然的苦味，适口性强。同时，该柚子酵素的发酵工艺参数，为进一步的实验研究提供了依据，并在产业化中具有一定的指导意义。