不同品种绵羊D-loop区遗传多样性研究

肖 帆，张利平，朗 侠，吴建平，张筱艳，靳继鹏

(1.甘肃农业大学 动物科学技术学院，兰州 730070；2.甘肃省农业科学院 畜草与绿色农业研究所，兰州 730070)

甘肃省的绵羊品种主要有甘肃高山细毛羊、蒙古羊、滩羊和藏羊等[1]。甘肃高山细毛羊是著名的毛肉兼用品种，由新疆细毛羊、高加索细毛羊与当地藏羊、蒙古羊杂交育成[2]。遗传多样性从狭义上来说，是指生物种内基因的变化。生物在长期演化过程中，产生遗传多样性的根本原因是遗传物质的改变，一个物种在进化过程中基因突变越多其遗传变异越丰富，且对环境变化有更强的适应能力[3]。线粒体DNA在生物的起源进化、遗传多样性、亲缘关系鉴定、保护动物的种质资源等方面具有很重要的意义。

动物细胞核外的遗传物质主要是mtDNA，它是动物起源进化及群体遗传分化的理想研究对象[4]。绵羊mtDNA物理结构包括编码区和非编码区。非编码区又称取代环(displacement loop，D-loop)，是线粒体基因组的控制区，位于 tRNApro和tRNAphe之间[5]。Dudu等[6]对无亲缘关系的绵羊D-loop区和cytb基因测序，结果发现有12个单倍型，单倍型多样度为0.897，核苷酸多样度为0.00437。Aljubouri等[7]通过研究伊朗3种多胎绵羊的D-loop区遗传多样性，发现它们在地理分布和表型性状上存在明显差异。Arora等[8]对3个不同地区的19个品种绵羊mtDNA多样性进行研究，结果发现在印度绵羊中共有37个单倍型，有两个不同的母系起源。通过对D-loop区测序来评估肥臀羊的亲缘关系，结果显示埃塞俄比亚东部绵羊有2个母系起源[9]。而对中国藏羊D-loop序列的分析表明，该品种有3个母系起源，在藏羊中没有单倍群D和E[10]。Fan等[11]分析表明，中国地方绵羊品种聚集到一个分支，而国外绵羊品种紧密聚集到另一分支。Zhao等[12]通过分析7个地区的16个地方品种mtDNA D-loop序列，发现在不同地区的所有品种中均存在A、B和C3种单倍群。汪琦等[13]揭示三江黄牛与秦川牛、平武牛亲缘关系较近。对mtDNA控制区进行分析显示山西肉用绵羊和小尾寒羊聚在一起，与其他6个国内外品种遗传关系较远[14]。杨会国等[15]分析显示在进化关系上和田羊与藏绵羊最近，这可能与它们在地理分布上距离较近有一定关系。韩旭等[16]研究发现家养绵羊至少有两大母系起源。郭彦斌等[17]发现两大母系起源中单倍型以亚洲A型为主，且摩佛伦羊对中国地方绵羊品种的起源与进化有较大 贡献。

本试验根据mtDNA的遗传特性，通过PCR扩增和基因测序的方法对甘肃高山细毛羊、欧拉羊、杜泊羊、湖羊、小尾寒羊和蒙古羊的mtDNA进行多态性分析，以期了解它们的遗传多样性，为绵羊遗传资源的合理开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

选取甘肃高山细毛羊、欧拉羊、杜泊羊、蒙古羊、小尾寒羊和湖羊为试验对象，试验羊来源与数量见表 1。取其颈静脉血5 mL，用EDTA抗凝，迅速送回实验室，-20 ℃冷冻保存，备用。

表1 实验动物信息Table 1 Experimental animal information

1.2 提取血液基因组DNA

采用DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取基因组DNA并通过分光光度计与琼脂糖凝胶电泳进行质量及浓度检测。

1.3 PCR反应

从GenBank(NCBI)中选取绵羊线粒体DNA序列(登录号为KP 702285.1)，利用Primers 5.0软件设计引物，上游引物：5′-AGCCAGTTGAACACCCCTAC-3；下游引物：5′-GACCCAGGTGCCTATATATTTACTTC-3′。预期扩增片段长度为1 422 bp，引物由金唯智有限公司合成。PCR扩增体系为20 μL。扩增程序为：预变性 94 ℃ 3 min；变性94 ℃ 30 s，退火66 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 90 s，35 个循环；总延伸72 ℃ 10 min。将检测合格的PCR产物送至生物公司进行DNA双向测序。

1.4 数据分析

测序结果利用MEGA 6.0软件进行比对分析，碱基含量分析利用纽普生物在线软件(http://www.novopro.cn/tools/dna_stats.html)进行；运用DnaSP对mtDNA D-loop区序列进行单一多态位点、简约信息位点、单倍型多样度(Haplotype diversity,Hd)、核苷酸多样度(Nucleotide diversity,Pi)、核苷酸平均差异数Kxy等遗传参数分析。用MEGA 6.0构建Neighbor-Joining系统发育树。

2 结果与分析

2.1 绵羊血液基因组DNA检测及PCR产物扩增结果

采用DNA提取试剂盒从采集的绵羊冷冻血中提取基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示提取的基因组DNA无降解，并且分光光度计检测OD值为 1.70～1.90。扩增产物大小与1 422 bp接近，符合目的片段大小，可以进行下一步试验。

2.2 测序结果

运用NCBI BLAST将试验绵羊序列与绵羊线粒体DNA标准序列(GenBank KP 702285.1)比对分析，结果显示同源性达 99%以上，测序峰图清晰可见，杂峰少，结合凝胶电泳检测结果，可以确定扩增片段为目的片段。

2.3 D-loop序列分析

对D-loop区序列分析结果见表 2，6 个地方绵羊品种mtDNA D-loop区4 种核苷酸序列中欧拉羊G含量(15.77%)最高，蒙古羊C含量 (23.35%)最高，杜泊羊A含量(33.51%)和T含量(29.41%)均最高，但杜泊羊的G含量 (14.06%)和C含量(23.03%)最低。GC含量低于AT含量，表明绵羊D-loop区中A、T碱基较为富集，且D-loop区为高突变区，碱基突变类型包括缺失、转换、颠换和插入，且碱基转换频率远高于碱基颠换频率。

表2 6 个地方绵羊品种mtDNA D-loop区核苷酸组成Table 2 Nucleotide composition of mtDNA D-loop region in 6 local sheep breeds %

2.4 遗传多样性分析

对6 个绵羊品种遗传多样性分析结果见表 3～5。共检测到171 个变异位点，其中单一多态位点58 个，简约信息位点113 个，单倍型为87 个。甘肃高山细毛羊和欧拉羊变异位点最多且相同，均为117 个；杜泊羊变异位点最少，有 65 个。从表 3 中可知，单一多态位点最多的是欧拉羊，最少的是杜泊羊。简约信息位点最多的是甘肃高山细毛羊。欧拉羊、蒙古羊和湖羊单倍型多样度相同且最高(Hd=1.000)，小尾寒羊单倍型多样度最低(Hd=0.933)。湖羊平均核苷酸差异度最大(K=31.622)，而杜泊羊最小(K=15.995)。核苷酸多样度最高的是湖羊(Pi=0.023 48)，最低的是杜泊羊(Pi=0.011 93)。

表3 6个绵羊品种遗传多样性参数Table 3 Genetic diversity index of 6 sheep breeds

如表 4 所示，6 个品种间蒙古羊与杜泊羊的核苷酸平均差异数Kxy最大，蒙古羊与欧拉羊核苷酸平均差异数Kxy最小，分别是 37.235 00和 22.126 32。同样，蒙古羊与杜泊羊核苷酸歧异度Dxy最大，蒙古羊与欧拉羊的核苷酸歧异度Dxy最小。

表4 6个绵羊品种间核苷酸平均差异数和核苷酸歧异度Table 4 Average nucleotide differences and nucleotide diversity among 6 sheep breeds

由表 5 可知，分化系数越高说明品种间分化度越高，6 个品种间杜泊羊与欧拉羊遗传分化系数最大，湖羊与蒙古羊遗传分化系数最小。小尾寒羊与湖羊的Nm值最小(Nm=0.002 03)，欧拉羊与杜泊羊的Nm最大(Nm=0.543 16)。

表5 6 个绵羊品种间遗传分化系数及基因流Table 5 Genetic differentiation coefficient and gene flow among 6 sheep breeds

2.5 系统发育树和遗传距离

由表 6 可知，小尾寒羊与湖羊的遗传距离最近，为 0.007；欧拉羊与杜泊羊的遗传距离最远，为 0.039。欧拉羊与小尾寒羊和湖羊的遗传距离均为 0.038。系统发育树结果表明(图 1)，6 个绵羊品种明显分为2 个分支，湖羊与小尾寒羊先聚集在一起，然后与杜泊羊聚为一类；欧拉羊与蒙古羊先聚为一类，然后与甘肃高山细毛羊聚为一大类。

表6 6 个绵羊品种间遗传距离Table 6 Genetic distance between 6 sheep breeds

3 讨 论

mtDNA D-loop区进化速率较高，因此常用来研究种间遗传多样性和系统发育关系。冯慧等[18]通过研究羚牛D-loop区发现，羚牛D-loop区一段序列的AT平均含量(56.3%)高于GC 含量(43.7%)。闫海龙等[19]对秦川牛线粒体 D-loop区的分析结果表明，D-loop区序列AT平均含量为 61.5%，GC含量为 38.5%。本研究通过对6 个绵羊群体的 D-loop区分析，结果表明D-loop区GC含量低于AT含量，表示D-loop区A和T碱基较为丰富，符合脊椎动物线粒体基因组中4 种碱基分布不均这一特点，与冯慧等[18]和闫海龙等[19]研究结果一致。

包鹏甲[20]对绵羊D-loop序列分析得出，单倍型比例在藏羊和甘肃高山细毛羊群体中较丰富，而在湖羊中较低。本研究中欧拉羊、蒙古羊和湖羊单倍型比率均为 100%，杜泊羊与小尾寒羊单倍型比率较低为 80%，甘肃高山细毛羊单倍型比率为95.83%，表示试验羊D-loop区的单倍型较丰富。核苷酸多样度(Pi)及单倍型多样度(Hd)是衡量种群遗传多样性水平的重要指标，其数值越高说明种群或群体的遗传多样性越高[21]。研究表明，将Hd=0.5 ,Pi=0.005作为分界点，即单倍型多样度(Hd)高于 0.5且核苷酸多样度(Pi)高于 0.005，则该种群遗传多样性水平较高[4]。本研究中6个绵羊群体的核苷酸多样度(Pi)均大于0.005，单倍型多样度(Hd)均高于 0.5，表明这6个绵羊群体具有丰富的遗传多样性，且具有较大的适应能力、生长能力和进化潜力，更容易开拓新环境。Liu等[22]研究显示藏羊单倍型多样度(Hd)、核苷酸多样度(Pi)和平均核苷酸差异度分别为 0.992、0.019和 19.635，本研究中欧拉羊的单倍型多样度(Hd)、核苷酸多样度(Pi)和平均核苷酸差异度分别为 1.000、0.014 63和 19.629，这与Liu等[22]研究结果相近。罗玉柱等[23]研究表明，中国绵羊群体的单倍型多样度在甘肃高山细毛羊、甘肃藏羊和小尾寒羊群体中较高，这与本研究结果一致。本研究中湖羊的单倍型多样度(Hd)、核苷酸多样度(Pi)和平均核苷酸差异度均最高，因此在6 个绵羊群体中湖羊的遗传多样性最丰富。河南奶山羊、萨能奶山羊、关中奶山羊和伏牛白山羊单倍型多样度(Hd)为 0.391～0.814，核苷酸多样度(Pi)的为 0.000 35～0.004 64[24]；而本研究中6个绵羊群体的单倍型多样度(Hd)为 0.933～1.000，核苷酸多样度(Pi)为 0.011 93～0.023 48，相比较而言，本研究中试验羊群体的遗传多样性更丰富。四川6 个地方绵羊群体单倍型多样度(Hd)为 0.780～0.995，核苷酸多样度(Pi)为 0.010 99～ 0.021 14，与本研究中6 个地方绵羊群体相比，甘肃地方绵羊群体遗传多样性更丰富[3]。

核苷酸歧异度Dxy是衡量群体多态程度的重要指标之一,其值越大,群体多态程度越高[25]。核苷酸歧义度Dxy在反映一个群体的mtDNA多态程度时比单纯的单倍型间的平均遗传距离精确[26]。本研究中核苷酸歧异度Dxy与核苷酸平均差异数Kxy结果相一致。蒙古羊和杜泊羊的核苷酸平均差异数Kxy最大，为 37.235 00；蒙古羊和欧拉羊的核苷酸平均差异数Kxy最小，是 22.126 32。王金文等[27]研究结果表明杜泊羊与小尾寒羊的核苷酸歧义度Dxy和核苷酸差异数Kxy分别是 0.061 8和 40.443 2，本研究结果相对较低，分别是0.021 20和 28.200 0，可能是地域环境不同造成这种差异。

基因流数据显示，各个种间基因流均小于 1，表明品种间基因交流较弱，群体分化程度较大[28]。研究表明遗传分化系数是反映遗传分化程度的一个指标[29]。闫春梅等[30]认为0.25

Chen等[31]用NJ方法构建系统发育树，结果表明所有家养山羊聚集在一起，所有绵羊亲缘关系较近，其中藏羊与呼伦贝尔羊的遗传距离较小，与其他羊种的遗传距离较大，这可能与栖息地或生态环境境差异有关。本研究中小尾寒羊和湖羊的遗传距离最近，说明小尾寒羊和湖羊亲缘关系最近，这与王亚磊等[32]研究结果一致。韩旭等[16]研究发现，中国地方绵羊品种与引入绵羊品种的遗传距离较远，本研究中欧拉羊与杜泊羊遗传距离最远，为 0.039，这与韩旭等[16]研究结果基本一致。系统发育树结果表明，湖羊与小尾寒羊先聚集在一起，然后和杜泊羊聚为一类；欧拉羊与蒙古羊先聚为一类，然后与甘肃高山细毛羊聚为一大类，表明湖羊与小尾寒羊遗传差异小，蒙古羊与欧拉羊遗传差异小。由于甘肃高山细毛羊有蒙古羊和藏羊的血缘，所以甘肃高山细毛羊与欧拉羊和蒙古羊聚为一类[2]。杜泊羊是从国外引入的品种，而小尾寒羊和湖羊均起源于蒙古羊，但是蒙古羊和欧拉羊聚为一类；湖羊和小尾寒羊与杜泊羊聚为一类，其原因可能是品种在演变过程中存在基因参入或长期自然选择、人工选择和地域隔离使遗传物质发生改变。

4 结 论

本研究中甘肃高山细毛羊、欧拉羊、杜泊羊、蒙古羊、小尾寒羊和湖羊均具有丰富的遗传多样性，其中湖羊对环境变化的适应能力更强。杜泊羊与国内绵羊品种存在较高的遗传分化。6 个绵羊品种分为2 个分支，小尾寒羊与湖羊亲缘关系最近，杜泊羊与欧拉羊亲缘关系最远。