经典名方桂枝加葛根汤标准汤剂HPLC指纹图谱研究

管咏梅，万鑫浩，吴文婷，孟晓伟，臧振中，钟凌云，陈丽华，刘义豪，董欢欢，朱卫丰

江西中医药大学 现代中药制剂教育部重点实验室，江西 南昌 330004

桂枝加葛根汤（Guizhi Jia Gegen Decoction，GJGD）出自东汉·张仲景著《伤寒论》[1]。由葛根四两、桂枝二两（去皮）、白芍二两、甘草（炙）二两、生姜三两、大枣十二枚6味药组成。具有解肌发表、升津舒经之功效，主治风寒客于太阳经输，营卫不和证。经典名方是我国中医药宝库中的伟大财富和智慧结晶，历史悠久，源远流长，其研制分为物质基准研制和制剂研制2个阶段。然而中药成分的复杂性使得保持其质量一致性成为质量控制的难点。鉴于中药组成的多样性和辨证施治的治疗方案，检测任何一种活性成分均不能代表其整体药效，中药指纹图谱能全面、定量地反映中药所包含的化学信息，是中药质量控制的有效手段，HPLC指纹图谱法也成为最常见的质量控制手段[2]。

目前，尚未见有关建立GJGD指纹图谱的研究报道，中药指纹图谱可以科学、系统、全面地反映中药的复杂化学成分组成[3]，化学模式识别技术可以将多个指标进行综合、降维和分类分析，对指纹图谱中的信息进行表达、识别和处理[4]，二者结合可以更加系统、全面地评价中药的质量，目前已被广泛用于经典名方质量控制。因此本研究通过HPLC法建立了GJGD标准汤剂指纹图谱，并对其进行相似度评价，同时结合聚类分析（clustering analysis，HCA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）及正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）等化学模式识别方法评价各批次样品间的质量差异，为完善GJGD物质基准的质量标准和实现后续相关制剂的深度质量控制提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪，美国Agilent公司；BSA124S分析天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；KQ-500VDE超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；SIGMA3-18 K高速冷冻离心机，德国SIGMA公司；H22-X2电陶炉，九阳股份有限公司；3 L荥经黑砂锅，荥经柴氏砂器文化发展有限责任公司。

1.2 材料

葛根素、葛根素芹菜糖苷、芍药苷、3′-羟基葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、甘草苷和甘草酸铵对照品，成都普菲生物科技有限公司，批号分别为19011507、21051103、20030901、18102401、21022610、19121801、19082902、19032004，质量分数依次为98.4%、99.6%、98.2%、98.6%、98.5%、98.51%、98.13%、98.9%；肉桂酸对照品，成都普思生物科技有限公司，批号PS000800，质量分数98.6%；没食子酸对照品，大连美仑生物科技有限公司，批号MB2707-S，质量分数98.5%；染料木苷对照品，成都克洛玛生物科技有限公司，批号CHB170223，质量分数98.9%。

葛根为豆科葛属植物野葛Pueraria lobata(Willd.) Ohwi的干燥根，桂枝为樟科樟属植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl的干燥嫩枝，白芍为毛茛科芍药属植物芍药Paeonia lactifloraPall.的干燥根，甘草为豆科甘草属植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根茎，生姜为姜科姜属植物姜Zingiber officinaleRosc.的新鲜根茎，大枣为鼠李科枣属植物枣Ziziphus jujubaMill.的干燥成熟果实。这6味药材均购于江中饮片公司，药材均由江西中医药大学葛菲教授鉴定。各饮片质量经本课题组前期检测均符合要求，采用随机数表法将不同批次药材进行组合，药材批号及产地组合信息见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

5C18-MS-IIC18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.1%磷酸水水溶液，梯度洗脱：0～3 min，5%～11%乙腈；3～15 min，11%乙腈；15～25 min，11%～15%乙腈；25～31 min，15%～20%乙腈；31～39 min，20%乙腈；39～43 min，20%～25%乙腈；43～48 min，25%～30%乙腈；48～52 min，30%～35%乙腈；52～57 min，35%～40%乙腈；57～61 min，40%～50%乙腈；61～66 min，50%～5%乙腈；66～67 min，5%乙腈；体积流量1.0 mL/min；进样量20 μL；检测波长：0～30 min，245 nm；30～60 min，280 nm；60～67 min，245 nm。

表1 15批GJGD物质基准 (S1～S15) 组方药材的批号及产地信息Table 1 Lot number and origin information of 15 batches (S1—S15) of decoction pieces in GJGD substance benchmarks

2.2 溶液的制备

2.2.1 GJGD标准汤剂的制备 《伤寒论》记载GJGD原方为“葛根（四两）、芍药（二两）、生姜（三两，切）、甘草（二两，炙）、大枣（十二枚，擘）、桂枝（二两，去皮）上六味，以水一斗，先煮葛根，减二升，去上沫，内诸药，煮取三升，去滓。温服一升，覆取微似汗，不须啜粥，余如桂枝法将息及禁忌。”根据《中国科学技术史·度量衡卷》[5]记载，东汉1升约为现今200 mL，一合约20 mL。基于“尊古不泥古”理念，通过文献查阅研究可知，古代经典名方应用时，不仅可根据前人考证的量制进行折算，更重要的是依据临床实践，因此结合临床用药，最终确定1两为当今3 g[6]。因此确定GJGD标准汤剂的制备方法为取葛根12 g、桂枝6 g、白芍6 g、甘草6 g、生姜9 g、大枣12枚。无需粉碎过筛，加水2000 mL，先加入葛根武火煮沸，文火熬去400 mL，去掉上沫，再加入其他5味中药，文火继续煮至600 mL，4层200目纱布滤过，即得。

2.2.2 混合对照品溶液的制备 取没食子酸、3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、芍药苷、大豆苷、甘草苷、染料木苷、肉桂酸、甘草酸铵对照品适量，精密称定，加甲醇制成母液，各吸取适量母液于10 mL量瓶中，用比例为5∶95的乙腈与0.1%磷酸水定容稀释，得各对照品质量浓度分别为26.83、27.64、24.29、30.36、28.50、25.90、18.28、36.48、21.44、26.89、26.66 μg/mL的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密量取“2.2.1”项下制备的GJGD标准汤剂5 mL，8000 r/min离心10 min，取上清液1 mL于10 mL量瓶中，超纯水稀释定容至刻度，过0.22 μm微孔滤膜即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 稳定性试验 取样品S5的供试品溶液适量，分别在制备后0、2、4、8、12、24 h在“2.1”项下条件测定，以16号峰（大豆苷）为参照，结果各共有峰相对保留时间的RSD均小于1%，相对峰面积的RSD均小于3.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.2 精密度试验 取同一份GJGD供试品溶液（S5），按“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，记录HPLC图，以大豆苷为参照峰，计算得到各共有峰的相对保留时间的RSD均小于1%，相对峰面积的RSD值均小于2.5%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验 取样品S5适量，按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件测定，以16号峰（大豆苷）为参照，结果各共有峰相对保留时间的RSD均小于1%，相对峰面积的RSD均小于2.0%，表明该方法重复性较好。

2.4 GJGD指纹图谱的建立

取15批GJGD供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样检测，记录色谱图。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”进行数据分析，以S1为参照图谱，时间窗宽度设定为0.1 min，采用中位数法，进行多点校正和全谱峰匹配，生成GJGD指纹图谱及对照指纹图谱（R），结果见图1。共标定29个共有峰，其中指认11个共有峰，分别为1号峰没食子酸、8号峰3′-羟基葛根素、11号峰葛根素、12号峰葛根素芹菜糖苷、13号峰3′-甲氧基葛根素、15号峰芍药苷、16号峰大豆苷、20号峰甘草苷、22号峰染料木苷、26号峰肉桂酸、28号峰甘草酸铵。

2.5 共有峰归属

取GJGD物质基准样品S1以及缺葛根、缺桂枝、缺白芍、缺甘草、缺干姜、缺大枣的阴性样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图。结合色谱峰的保留时间及紫外吸收图，通过对比分析，对29个共有峰进行归属，见图2。结果发现5味组方饮片对GJGD物质基准指纹图谱均有贡献，其中3～14、16～19、21～25号峰来自葛根，26号峰来桂枝；1、15号峰来自白芍，20、27～29号峰来自甘草，2号峰来自大枣。在29个共有峰中，葛根占据21个，表明君药葛根对于该复方的化学成分表征非常重要。

2.6 相似度分析

以对照指纹图谱为参照，计算15批GJGD样品图谱相似度分别为0.998、0.999、0.999、0.999、0.999、0.965、0.999、0.999、0.998、0.999、0.941、0.997、0.989、0.999、0.976，相似度良好，均在0.90以上，表明所建立的GJGD标准汤剂指纹图谱质量稳定，可以反映其指纹特征。样品S6、S11、S13、S15与对照图谱的相似度均小于0.990，其他样品都大于0.990，说明不同批次药材的物质基准存在一定的质量差异。

2.7 HCA

HCA常用于数据的初步探索性分析，具有直观、结论形式简明的优点[7-8]。采用SPSS 21.0数据分析软件，对15批样品的共有峰的相对峰面积进行系统聚类，采用组间连接法，测量区间为平方欧氏距离，聚类结果见图3，结果发现当欧氏距离为10时，15批GJGD物质基准可分为2类，即样品S6、S11、S13、S15为第1类，样品S1～S5、S7～S10、S12、S14为第2类，此结果可与相似度评价结果相互印证。

2.8 PCA[9]

选择15批GJGD物质基准的29个共有峰的峰面积为变量，导入SIMCA-P＋14.1（Demo）软件进行PCA处理，得分矩阵图见图4。结果发现15批GJGD物质基准分布能分成2组，样品S6、S11、S13、S15为一组，样品S1～S5、S7～S10、S12、S14为第2组，与HCA结果一致。

2.9 OPLS-DA[10-12]

将15批GJGD物质基准的29个共有峰的峰面积导入SIMCA-P＋14.1（Demo）软件进行OPLS-DA处理，得分矩阵图见图5。结果发现15批样品聚为2类，样品S6、S11、S13、S15为一组，样品S1～S5、S7～S10、S12、S14为第2组，2组样品聚类效果良好，且与PCA和HCA结果一致。图6中的点离原点越远，表明对应变量（色谱峰）权重值越大[13-14]，结合以变量重要性投影（VIP）值＞1为判定标准，筛选差异组分，见图7。结果共找到了11个成分，按VIP值大小排序分别为11（葛根素）、13（3′-甲氧基葛根素）、21、12（葛根素芹菜糖苷）、5、22（大豆苷）、19、18、1（没食子酸）、4、8（3′-羟基葛根素）号峰。上述11个差异成分中10个来自葛根，1个来自白芍，进一步说明严格控制葛根药材质量是确保GJGD物质基准质量稳定的关键。

3 讨论

3.1 色谱条件分析

图1 15批GJGD物质基准 (S1～S15) 的HPLC指纹图谱 (A) 及其共有模式 (B) 和混合对照品的HPLC图 (C)Fig.1 HPLC fingerprints (A) and its common mode (B) of 15 batches (S1—S15) of substance benchmarks of GJGD and HPLC of mixed reference substances (C)

图2 GJGD物质基准的特征峰归属Fig.2 Attribution of characteristic peaks in substance benchmarks of GJGD

图3 15批GJGD物质基准的HCA树状图Fig.3 Dendrogram of 15 batches of GJGD substance benchmarks by HCA

图4 15批GJGD物质基准的PCA得分Fig.4 PCA scoring plots of 15 batches of substance benchmarks of GJGD

图5 15批GJGD物质基准OPLS-DA的得分矩阵Fig.5 OPLS-DA scoring plots of 15 batches of substance benchmarks of GJGD

图6 GJGD物质基准的OPLS-DA载荷散点Fig.6 OPLS-DA loading plots of GJGD substance benchmarks

图7 GJGD汤物质基准OPLS-DA的VIP值Fig.7 VIP values of OPLS-DA of GJGD substance benchmarks

本实验采用分别考察了在水-乙腈、水-甲醇、0.1%磷酸水溶液-乙腈以及0.05%磷酸水溶液-乙腈4种不同的流动相体系下色谱峰的分离情况，结果显示流动相为水-乙腈、水-甲醇时，色谱峰峰形较差，分离度不好。流动相为0.1%磷酸水溶液-乙腈以及0.05%磷酸水溶液-乙腈时，有较好的色谱峰峰形，分离度较好，无明显拖尾，且两者相差不大， 因此选择0.1%磷酸水溶液-乙腈为流动相。同时，对245、255、260、270、280 nm等不同检测波长进行了考察，发现肉桂酸和甘草苷在280 nm处响应值最高，在245 nm处偏低，其他各成分在245 nm处响应值都较高，各峰响应值较高，综合考虑基线、峰形、峰数、指标成分分离度及响应值等因素，最终确定多波长切换法，分别为245 nm（0～30 min，60～67 min，色谱峰数最多）、280 nm（30～60 min，检测甘草苷、肉桂酸）。另外，考察了柱温（20、25、30 ℃）对色谱峰分离度的影响，结果发现在30 ℃条件下，各色谱峰分离度较好。

3.2 指标成分的选择

中药是具有复杂成分的有机整体，药效的发挥并非是单一有效成分的作用，而是其所含多元化活性成分共同作用的结果[15]。建立经典名方物质基准指纹图谱时应综合考虑全方，选择具有代表性且与药效相关性强的成分作为质控指标，使物质基准能准确反映原方质量，以助于更好地发挥物质基准的参照物功能，保证经典名方制剂的质量[16]。GJGD是由葛根、桂枝、白芍、甘草、生姜、大枣这6味药组成，其中葛根为君药，具有解肌退热、透疹、生津止渴、升阳止泻作用。桂枝、白芍均为臣药，桂枝具有发汗解表、散寒止痛、通阳化气作用，白芍具有养血调经，敛阴止汗，柔肝止痛，平抑肝阳。甘草为佐药，大枣、生姜为使药。诸药并用，共奏解肌发表，升津舒经之效。本实验通过对照品共指认出11个成分，其中包括葛根中主要有效成分葛根素、葛根素芹菜糖苷、3′-羟基葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、染料木苷。桂枝中主要有效成分肉桂酸。白芍中主要有效成分芍药苷、没食子酸。甘草中主要有效成分甘草苷、甘草酸按。在葛根中，解热镇痛的主要成分为异黄酮类成分，已有研究表明，葛根素能起到解热作用，但并不是指在葛根中葛根素是发挥解热作用的唯一有效成分[17]，而葛根素、葛根素芹菜糖苷、3′-羟基葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、染料木苷均属于异黄酮类成分，结合药理作用，能被选择为指标成分之一。桂枝中主要含有桂皮醛、肉桂酸等成分发挥解热、镇痛、抑菌、抗病毒作用[18]。白芍和甘草的主要有效成分芍药苷、没食子酸、甘草苷、甘草酸铵等，均为《中国药典》2020年版单味药项下规定的指标性成分。因此，本实验对GJGD汤物质基准HPLC指纹图谱中11个色谱峰进行了指认，可为后续含量测定等关键质量控制环节研究奠定基础。

3.3 供试品溶液制备方法的选择

前期实验考察过取水煎液25 mL于锥形瓶中，加等体积的甲醇，称定质量，超声处理30 min，放冷，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，离心10 min（转速为8000 r/min）；精密吸取上清液2 mL于10 mL量瓶中，50%甲醇定容，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。发现色谱峰峰形不整齐，且各指标性成分峰面积过小，不利于观察研究。后再次考察直接利用水煎液离心再滤过进样，发现各色谱峰面积过大，葛根素是当中峰面积最大成分，面积超过标准，但其他指标成分和未指认出的色谱峰峰形均良好且面积不小，故再次修改方法，最终确定把水煎液离心后利用超纯水稀释10倍后过滤进样，得到的各色谱峰均符合要求。

3.4 总结

经典名方是我国中医药文化宝藏，在国家政策的扶持下，经典名方已经成为当今热点。而经典名方物质基准的制备开发，关键在于现代生产工艺与传统工艺保持“基本一致”，即投料用饮片质量一致，生产工艺条件一致。因此，需要对药材、饮片、中间体及物质基准进行质量控制[19-20]。本研究采用HPLC法建立GJGD指纹图谱，并结合多元统计分析，能够较为全面地对GJGD标准汤剂进行质量评价，为GJGD物质基准及后续复方制剂的质量控制研究提供参考。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突