江香薷乙酸乙酯成分及其抑制α-葡萄糖苷酶活性分析

邹 毅，潘建萍，周 敏

（赣南卫生健康职业学院，江西赣州 341000）

江香薷（Mosla chinensis）为唇形科石荠苎属植物，以干燥地上部分入药，属药食同源品种，为江西省的大宗药材之一，主产于新余市分宜县和渝水区等地。江香薷味辛，微温，具有发汗解表，化湿和中的功效，可用于治疗暑湿感冒、恶寒发热、头痛无汗、腹痛吐泻、水肿、小便不利等病症[1]。国内外关于该植物的形态、资源、化学成分及生物活性研究报道较多，且发现该植物包含挥发油、生物碱、苷类、多糖、黄酮等多种化学成分，具有抗菌、调血脂、降糖、抗氧化、提高免疫力等药理活性[2-3]。然而，目前研究多集中于具有抗炎、抗病毒等活性的挥发油成分的研究，对于其他成分的药理活性研究报道甚少。α-葡萄糖苷酶抑制剂（AGI）是治疗Ⅱ型糖尿病（DM）常用的口服药物，目前已上市的有阿卡波糖、伏格列波糖等，但其胃肠道方面副作用明显，从天然产物中筛选新的AGI的研究越来越受到广泛关注。本课题组从江香薷中分离了7个化合物，并从中筛选出具有较强抑制α-葡萄糖苷酶活性的化合物。

1 材料及仪器

江香薷全草于2020年采自新余市分宜县，全草性状符合相关文献描述[2]，经赣南医学院副教授胡海波鉴定为江香薷（Mosla chinensis）。

Inova 500型核磁共振仪，TMS内标；Shimadzu LC-6AD液相色谱仪，制备柱YMC-Pack ODS-A；HP-20大孔吸附树脂；LH-20型葡聚糖凝胶，Amersham Pharmacia Biotech公司；反相硅胶柱，日本YMC公司；柱色谱硅胶G；硅胶GF254；试剂为色谱纯或分析纯级别；MK3酶标仪（Thermo Lab systems公司）；96孔板（上海一研生物科技有限公司）；PNPG、阿卡波糖（纯度≥98%），上海研生实业有限公司。

2 提取分离

将6 kg干燥的江香薷地上部分切碎，用95%乙醇回流提取3次，合并提取液，减压浓缩至无醇味后得乙醇总浸膏。将总浸膏加水混悬，分别用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取。乙酸乙酯部位（38 g）经硅胶柱色谱（氯仿∶甲醇，1∶0→1∶1）梯度洗脱得到8个组分（A-H）。B组分（3.3 g）经硅胶柱色谱（石油醚∶乙酸乙酯，3∶1）、Sephadex LH-20柱色谱（甲醇）和制备液相色谱得化合物1（8.5 mg）、化合物2（5.2 mg）和化合物3（7.5 mg）。C组分（8.3 g）经硅胶柱色谱和制备液相色谱分别得化合物6（2.8 mg）和化合物7（3.7 mg）。E组分（6.6 g）经Sephadex LH-20柱色谱（甲醇）、硅胶柱色谱（氯仿-甲醇-水，10∶1∶0.1)得到化合物4（3.8 mg）和化合物5（5.6 mg）。

3 化合物鉴定

从江香薷乙酸乙酯部位分离得到的化合物依据实验测试结果，鉴定结果如下，化合物结构如图1所示。

图1 江香薷乙酸乙酯部位分离得到的化合物结构图

（1）化合物 1。白色粉末，ESI-MSm/z：435[M+H]+。1H-NMR（MeOH-d4，500 MHz）δ：6.60（1H，s，H-2′），6.40（1H，s，H-2，6），4.32（1H，d，J=5.5 Hz，H-7），2.71，2.59（each1H，m，H-7′），1.98（1H，m，H-8），1.64（1H，m，H-8′），3.60（2H，m，H-9），3.51（2H，m，H-9′），3.87（3H，s，3′-OMe），3.75（6H，s，3，5-OMe），3.39（3H，s，5′-OMe），4.84，4.40（2H，t，-CH2OH）。13C-NMR（MeOH-d4，125 MHz）δ：139.3（C-1），106.9（C-2，6），149.0（C-3，5），134.5（C-4），42.3（C-7），49.8（C-8），64.2（C-9），130.2（C-1′），107.8（C-2′），148.7（C-3′），138.3（C-4′），147.7（C-5′），126.2（C-6′），33.6（C-7′），40.9（C-8′），66.8（C-9′），56.8（3，5-OMe），60.1（3′-OMe），56.6（5′-OMe）。以上数据与文献[3]报道一致，鉴定该化合物（+）lyoniresino（l南烛树脂酚）。

（2）化合物2。白色粉末，ESI-MSm/z：383[M+Na]+，359[M －H]－。1H-NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：6.62（1H，d，J=1.5 Hz，H-2），6.67（1H，d，J=8 Hz，H-5），6.47（1H，dd，J=8，1.5 Hz，H-6），3.73（1H，d，J=9.5 Hz，H-7），1.83（1H，m，H-8），6.59（1H，s，H-2′），6.07（1H，s，H-5′），2.71～2.61（2H，m，H-7′），1.60（1H，m，H-8′），3.43（2H，m，H-9），3.14（1H，m，H-9′），3.56（1H，m，H-9′），3.68（3H，s，OMe-3），3.69（3H，s，OMe-3′），8.42，8.73（2H，s，Ar-OH），4.84，4.40（2H，t，-CH2OH）；13C-NMR（DMSO-d6，125 MHz）δ：127.1（C-1），111.8（C-2），145.5（C-3），144.1（C-4），116.2（C-5），132.5（C-6），32.3（C-7），38.0（C-8），63.5（C-9），136.2（C-1′），106.6（C-2′），147.8（C-3′），133.7（C-4′），147.6（C-5′），106.6（C-6′），46.5（C-7′），45.7（C-8′），59.7（C-9′），55.5（OMe-3），56.0（OMe-3′，5′）。以上数据与文献[4]报道一致，鉴定该化合物为(-)-5-甲氧基异落叶松树脂素（(-)-5-methoxyisolariciresinol）。

（3）化合物 3。无色油状，ESI-MSm/z：381[M+Na]+，1H-NMR（500 Mz，CDCl3）δ：6.80～6.89（6H，Ar-H），4.78（2H，d，J=4.0 Hz，H-7，7′），4.28（2H，dd，J=9.0，7.0 Hz，H-9a，9a′），3.91（2H，dd，J=9.0，7.0 Hz，H-9b，9b′），3.96（6H，s，3，3′-OCH3），3.15（2H，m，H-8，8′）。13C-NMR（150 Mz，CDCl3）δ：133.1（C-1，1′），108.7（C-2，2′），146.8（C-3，3′），145.4（C-4，4′），114.4（C-5，5′），119.1（C-6，6′），86.0（C-7，7′），54.3（C-8，8′），71.8（C-9，9′），56.1（3，3′-OCH3）。以上数据与文献[5]报道一致，鉴定该化合物为pinoresinol（松脂醇）。

（4）化合物 4。白色粉末，1H-NMR（500 Mz，MeOH-d4）δ：7.02（1H，brs，H-2），7.14（1H，d，J=8.0 Hz，H-5），6.91（1H，d，J=8.0，1.5 Hz，H-6），6.65（2H，s，H-2′，6′），4.75（1H，brs，H-7），4.71（1H，brs，H-7′），4.25，3.88（each 1H，m，H-9），3.68，3.40（each 1H，m，H-9′），3.12（2H，brs，H-8，8′），3.86（3H，s，3-OCH3），3.84（6H，s，3′，5′ -OCH3），4.87（1H，d，J=7.0 Hz，Glc-1）。13C-NMR（125 Mz，MeOH-d4）δ：136.2（C-1），111.6（C-2），151.0（C-3），147.5（C-4），118.0（C-5），119.8（C-6），87.0（C-7），55.5（C-8），72.8（C-9），133.1（C-1′），104.5（C-2′，6′），149.3（C-3′，5′），137.5（C-4′），87.6（C-7′），55.5（C-8′），72.7（C-9′），56.8（3-OCH3），56.8（3′，5′ -OCH3），102.8（Glc-1），74.9（Glc-2），77.8（Glc-3），71.3（Glc-4），78.2（Glc-5），62.5（Glc-6）。以上数据与文献[6]报道一致，鉴定该化合物为isoeucommin A。

（5）化合物 5。白色粉末，1H-NMR（500 Mz，DMSO-d6）δ：6.67（2H，brs，H-2，6），6.61（2H，s，H-2′，6′），4.71（1H，brs，H-7），4.63（1H，brs，H-7′），4.19，3.80（each 2H，m，H-9，9′），3.06（2H，brs，H-8，8′），3.77（6H，s，3，5-OCH3），3.76（6H，s，3′，5′-OCH3），4.90（1H，d，J=7.0 Hz，Glc-1）。13C-NMR（125 Mz，DMSO-d6）δ：137.3（C-1），103.7（C-2，6），152.7（C-3，5），133.8（C-4），85.1（C-7），53.7（C-8），71.3（C-9），131.3（C-1′），102.7（C-2′，6′），148.0（C-3′，5′），135.0（C-4′），85.4（C-7′），53.7（C-8′），71.2（C-9′），56.5（3，5-OCH3），56.1（3′，5′ -OCH3），104.2（Glc-1），74.2（Glc-2），76.6（Glc-3），71.2（Glc-4），77.3（Glc-5），61.0（Glc-6）。以上数据与文献[7]报道一致，鉴定该化合物为丁香树脂醇-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（episyringaresinol-4-O-β-D-glucopyranoside）。

（6）化合物6。黄色粉末，1HNMR（400 MHz，DMSO）δ：7.67（1H，d，J=2.0 Hz，H-2′），7.55（1H，dd，J=8.4，2.0 Hz，H-6′），6.89（1H，d，J=8.4 Hz，H-5′），6.39（1H，brs，H-8），6.18（1H，brs，H-6），以上数据与文献[8]报道一致，鉴定该化合物为槲皮素（quercertin）。

（7）化合物 7。黄色粉末，1HNMR（400 MHz，DMSO）δ：8.04（1H，d，J=8.0 Hz，H-2′，6′），6.91（1H，d，J=8.0 Hz，H-3′，5′），6.40（1H，brs，H-8），6.16（1H，brs，H-6），以上数据与文献报道一致，鉴定该化合物为山奈酚（kaempferol）。

4 抑制α-葡萄糖苷酶活性的筛选

参考文献[9]方法，以PNPG为底物，在96微孔板上测定α-葡萄糖苷酶活性，并用阿卡波糖作为阳性对照。取102 μL 磷酸钾缓冲液（pH6.8），加入 6 μLDMSO，15 μLα-葡萄糖苷酶（0.1 U/mL），恒温（37 ℃）反应10 min，加入15 μLPNPG（1.2 mmol/L）， 恒 温（37 ℃）反 应 10 min， 加60 μLNa2CO3，在405 nm 波长处测吸光度值A。计算酶活性抑制率 =［1-(A样品组-A样品空白组)/(A阴性组-A空白组)］×100%，用Origin6.0求对应的IC50。酶活性抑制作用结果见表1，由表可知，化合物1、6、7对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用较强，其抑制率分别为88.57%、94.11%、90.18%。IC50分 别 为（47.15±0.41）mg/L、（39.28±0.30）mg/L、（42.34±0.62）mg/L。

表1 江香薷乙酸乙酯分离成分的α-葡萄糖苷酶抑制活性（±s，n=3）

表1 江香薷乙酸乙酯分离成分的α-葡萄糖苷酶抑制活性（±s，n=3）

化合物抑制率/（%）IC50/(mg/L)化合物抑制率/（%）IC50/(mg/L)1 88.57 47.15±0.41 5 33.34 79.57±0.32 2 42.12 72.07±0.32 6 94.11 39.28±0.30 3 30.15 82.19±0.65 7 90.18 42.34±0.62 4 78.65 49.33±0.22 阿卡波糖 96.23 36.21±0.37

5 酶抑制类型的确定

分别取化合物1、6、7两个不同浓度，PNPG取4个不同浓度，根据Lineweave-Burk作图法，分别绘制3个化合物的抑制作用动力学曲线，见图2、图3和图4。

图2 化合物1 Lineweave-Burk曲线

图3 化合物6 Lineweave-Burk曲线

图4 化合物7Lineweave-Burk曲线

由上图可知，化合物1对α-葡萄糖苷酶抑制作用为竞争性抑制，化合物浓度增大而反应速度Vmax不变，根据竞争性抑制动力学方程计算其Ki为37.6 mg/L。化合物6、7则属于非竞争性抑制剂，Vmax随浓度的增大而减小，根据非竞争性抑制动力学方程求出2个化合物的Ki分别为156.2 mg/L、3.09 mg/L。

6 结论

目前对于江香薷多集中于具有抗炎、抗病毒等活性的挥发油成分的研究，而本课题首次利用体外筛选模型对江香薷乙酸乙酯萃取物抑制α-葡萄糖苷酶活性成分进行了研究，从中分离鉴定出7个化合物。其中，化合物1～5为首次从该植物中分离得到。利用96微孔板PNPG法评价化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，筛选出较强抑制酶活性的化合物1、6、7，其中化合物1属于竞争性抑制，化合物6、7属于非竞争性抑制。本研究有助于加快江香薷资源的现代化开发，并为深入研究天然AGI药物提供方向。