文香菇多糖联合阿霉素对胃癌SGC7901细胞凋亡及耐药基因表达的影响

王海凤，胡江波，许梦婷，唐赛赛

（山东中医药高等专科学校，山东烟台 264199）

香菇是起源于我国的世界第二大食用菌［1］。香菇多糖（Lentinan，LNT）是一种从香菇中提取的活性成分，是纯化的β-1,3-葡聚糖［2］。目前，香菇多糖在临床上被广泛用于肿瘤的辅助治疗。肿瘤耐药性的产生是导致治疗失败的主要原因，逆转肿瘤耐药性是提高肿瘤治疗疗效的关键。本研究以胃癌细胞SGC7901为模型，探讨香菇多糖联合阿霉素对胃癌细胞凋亡及耐药基因表达的影响，为香菇多糖抗肿瘤作用机制提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人胃癌细胞株SGC7901购自上海美轩生物科技有限公司。

1.2 试剂

香菇多糖（批号1902271）、注射用盐酸阿霉素（ADR）（25 mg，批号：G1823064）、RPMI-1640完全培养基（KGM31800S-500）、CCK8法细胞增殖检测试剂盒（KGA317）、Trizon Reagent（CW0580S）、Ultrapure RNA超 纯RNA提 取 试 剂 盒（CW0581M）、HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒（CW2569M）、UltraSYBR Mixture（CW0957M），均购自北京康为世纪生物科技有限公司；Annexin V-APC/7-AAD apoptosis kit（AP105-100kit）购自MULTI SCIENCES公司。

1.3 仪器

CO2培养箱（BPN-80CW），上海一恒科学仪器有限公司；倒置荧光显微镜（MF53），广州市明美光电有限公司；多功能酶标仪（02L3006），TECAN；荧光 PCR仪（CFX Connect™实时），伯乐生命医学产品（上海）有限公司；低温高速离心机（TGL-16D），常州中捷实验仪器制造有限公司；NovoCyte™流式细胞仪（NovoCyte 2060R），艾森生物（杭州）有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 CCK8法检测香菇多糖对SGC7901细胞增殖的影响

实验设7组，分为空白对照组、6个不同浓度香菇多糖实验组。取对数生长期SGC7901细胞以1×104个/孔接种于96孔板的100 μL培养液中，培养至贴壁约70%。实验组向完全培养基中按20%的比例加入用RPMI1640培养液稀释的不同浓度的香菇多糖，使其终浓度依次为10 μg/mL、30 μg/mL、50 μg/mL、70 μg/mL、100 μg/mL 和 200 μg/mL， 空 白 对 照组加等体积培养液，每组设3个复孔，培养48 h，每孔加入10 μL CCK8检测溶液，再置于培养箱中孵育4 h，振荡混匀，在酶标仪上于波长450 nm处读取光密度值（OD值），重复实验3次，计算细胞生长率，见式（1）。以生长率大于90%的最高药物浓度作为非细胞毒性浓度，作为后续实验的给药量。

细胞生长率=(实验组平均OD值/对照组平均OD值 )×100%。

1.4.2 细胞造模及分组

取对数生长期SGC7901细胞，弃去细胞培养上清，用1×PBS洗两遍，用0.25%胰酶（含0.02% EDTA）消化，离心、洗涤、重悬，按40%比例将细胞接种于6孔板，待细胞完全贴壁后，弃去上清，设空白对照组、阿霉素组（ADR组）、阿霉素和香菇多糖联合用药组（ADR+LNT组）。空白对照组加培养液1 000 μL，ADR组向SGC-7901细胞中加入含ADR（5.0 μg/mL）的培养液 1 000 μL，ADR+LNT 组向 SGC-7901细胞中加入含ADR（5.0 μg/mL）与20%香菇多糖（终浓度为上述非细胞毒性浓度）培养液1 000 μL，培养48 h后进行流式检测和PCR检测。

1.4.3 流式细胞仪检测阿霉素与香菇多糖联合用药对细胞凋亡的影响

收集1×106～3×106个细胞，加1 mL PBS，1 500 r/min离心3 min，洗2遍，用双蒸水将5×Binding Buffer稀释为1×Binding Buffer，取 300 μL 预冷的 1×Binding Buffer重悬细胞。每管各加入3 μL的Annexin V-APC和5 μL的7-AAD，混匀后，室温避光孵育10 min，再向每管中加入200 μL预冷的 1×Binding Buffer，上机检测。

1.4.4 qPCR检测香菇多糖对多药耐药相关基因的影响

按试剂盒说明书，抽提各组SGC7901细胞总RNA，逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，在荧光定量PCR仪上进行检测，以GAPDH为内参，计算出各组ZNF139、MRP-1、MDR1的相对表达量。ZNF139、MRP-1、MDR1引物序列见表1。

表1 ZNF139、MRP-1、MDR1引物序列表

反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。每个实验重复3次取平均值，检测各组SGC7901细胞内ZNF139、MRP-1、MDR1表达情况。1.4.5 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，定量资料采用平均数±标准差（±s）表示，独立样本之间比较采用方差分析，以P＜0.05作为显著性差异。

2 结果与分析

2.1 不同浓度香菇多糖对SGC7901细胞增殖的影响

由表2可知，30 μg/mL香菇多糖（生长率93.3%）为非细胞毒性浓度，作为后续实验的给药量。

表2 不同浓度香菇多糖对SGC7901细胞增殖影响表（±s ，n=3）

表2 不同浓度香菇多糖对SGC7901细胞增殖影响表（±s ，n=3）

注：与空白对照组比较，*表示P＜0.05，#表示P＜0.01。

组别OD值生长率/（%）空白对照组 1.25±0.11 100 10 μg/mL 香菇多糖组 1.27±0.15 103.9±17.3 30 μg/mL 香菇多糖组 1.15±0.11 93.3±15.5 50 μg/mL 香菇多糖组 1.11±0.09 89.9±13.2 70 μg/mL 香菇多糖组 1.07±0.14* 86.9±17.4 100 μg/mL 香菇多糖组 0.88±0.12# 71.0±10.9*200 μg/mL 香菇多糖组 0.12±0.12# 9.8±1.03#

2.2 香菇多糖对SGC7901细胞凋亡率的影响

由表3可知，与空白对照组比，ADR组和ADR+LNT组SGC7901细胞凋亡率明显升高（P＜0.01）。与ADR组相比，ADR+LNT组SGC7901细胞凋亡率明显升高（P＜0.01）。

表3 香菇多糖对SGC7901细胞凋亡率的影响表（±s ，n=3）

表3 香菇多糖对SGC7901细胞凋亡率的影响表（±s ，n=3）

注：*表示与空白对照组比较，P＜0.01；#表示与ADR组比较，P＜0.01。

组别凋亡率/（%）空白对照组 6.27±0.43 ADR 组 8.44±0.03*ADR+LNT 组 11.73±0.25*#

2.3 香菇多糖对SGC7901细胞耐药基因表达的影响

由表4可知，与空白对照组比，ADR组ZNF139、MDR1、MRP-1基 因 的 表 达 明 显 升 高（P＜ 0.01），ADR+LNT组MRP-1基因的表达明显降低。与ADR组相比，ADR+LNT组ZNF139、MRP-1基因的表达明显降低（P＜0.01），MDR1表达有降低趋势但无显著性差异。

表4 香菇多糖对SGC7901细胞ZNF139、MDR1、MRP-1表达的影响表（±s ，n=3）

表4 香菇多糖对SGC7901细胞ZNF139、MDR1、MRP-1表达的影响表（±s ，n=3）

注：*表示与空白对照组比较，P＜0.01；#表示与ADR组比较，P＜0.01。

组别 ZNF139 MDR1 MRP-1空白对照组 1±0 1±0 1±0 ADR 组 1.75±0.10* 1.35±0.15* 1.45±0.14*ADR+LNT 组 1.05±0.09# 1.12±0.13 0.63±0.05*#

3 讨论

化疗可有效遏制胃癌细胞的增殖，但在化疗中胃癌细胞多药耐药（MDR）的产生常导致化疗效果不佳［3］。阿霉素是广谱抗肿瘤药物，其本身毒性较大，但治疗效果明显，至今依然沿用。2017年阿霉素被世界卫生组织国际癌症研究机构统计在致癌物清单中，所以减少用量以及与其他抗癌药物联用成了新的研究趋势。

本实验通过不同浓度香菇多糖对SGC7901细胞增殖的影响发现（表2），低浓度香菇多糖（10 μg/mL）对SGC7901细胞增殖有一定的促进作用，当香菇多糖浓度达到30 μg/mL时开始抑制细胞增殖，当香菇多糖浓度达到100 μg/mL及以上时可显著抑制SGC7901细胞增长（P＜0.05、（P＜0.01），表明香菇多糖必须达到一定的药物浓度方能起到抗肿瘤作用。通过流式检测细胞凋亡实验发现（表3），香菇多糖联合阿霉素应用可明显诱导胃癌SGC7901细胞凋亡的发生，说明香菇多糖与阿霉素联合应用可促进胃癌细胞凋亡的发生，为阿霉素联合用药提供实验依据。

介导肿瘤耐药的蛋白包括P-糖蛋白（P-Glycoprotein，P-gp）、多药耐药相关蛋白（Multidrug Resistance-Associated Protein，MRP）、锌指蛋白（ZNF）等［3-5］。本研究通过qPCR检测各组胃癌细胞SGC7901耐药相关基因ZNF139、MDR1、MRP的表达，结果显示（表4），与空白对照组比较ADR组ZNF139、MDR1、MRP-1基因的表达明显升高（（P＜0.01），表明阿霉素可通过促进胃癌细胞耐药基因的表达导致化疗失败。与空白对照组相比ADR+LNT组MRP-1基因的表达明显降低，与ADR组相比ADR+LNT组ZNF139、MRP-1基因的表达明显降低（（P＜0.01），MDR1表达有降低趋势但无显著性差异，表明香菇多糖与ADR联合应用可抑制SGC7901/ADR细胞多药耐药相关基因ZNF139、MRP-1的表达。

4 结论

本研究初步表明香菇多糖可抑制胃癌SGC7901细胞的增殖，与阿霉素联合应用可促进SGC7901细胞凋亡，亦可抑制胃癌SGC7901细胞耐药基因ZNF139、MRP-1的表达而逆转化疗中对阿霉素耐药的发生。