橘子皮中柠檬烯闪式提取工艺的优化

王晓雯，杨姗姗，奚 玮，徐 慧

（青岛市食品药品检验研究院，山东青岛 266071）

柠檬烯是天然物质，具有无毒特性，经FDA批准可以食用，FAO和WHO对柠檬烯的ADI（每日允许摄入量）也不作限量规定。柠檬烯具有多种生理活性和生物功效，有杀虫、抑菌、抗菌消炎和抗肿瘤的功效。柠檬烯是一种单萜类化合物，具有抗氧化活性，在氧气和光照环境中不稳定，易氧化，快速、高效的提取方法是提高提取率的关键。本实验以柠檬烯得率为评价指标，通过单因素正交试验确定提取橘子皮中柠檬烯的最佳闪式提取条件[1-6]。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 7890型气相色谱仪，带火焰离子化检测器；闪式提取仪，无锡广蕴生化科技有限公司；高速离心机，美国Tomas公司；涡漩混合器，金坛市亿通电子有限公司；均质器，德国IKA公司；固相萃取装置，Supelco公司；石墨化碳黑固相萃取SPE小柱（6 mL，500 mg），Supelco公司。

1.2 提取影响因素分析

影响提取效率的因素主要有提取溶剂种类、料液比、提取时间、提取次数等，本研究在固定其他因素的前提下，以柠檬烯得率为评价指标进行研究，分析以上单因素工艺条件对柠檬烯得率的影响，采用正交设计优化最佳工艺条件。

1.3 实验方法

（1）橘子皮中柠檬烯提取的实验室工艺流程。干橘子皮→粉碎→闪式提取→离心→石墨化；碳黑固相萃取SPE小柱净化→旋转蒸发浓缩至无正己烷→正己烷溶解残渣定容至10 mL，气相色谱测定。

（2）柠檬烯得率的测定。柠檬烯得率（%）=c×v/m×100%，其中c-提取液中柠檬烯浓度（g/mL），v-定容体积（mL），m- 试样质量（g）。

（3）气相色谱仪器条件。色谱柱：DB-1柱30 m×0.32 mm×1.0 μm；柱箱温度：100 ℃（2 min）以 10 ℃/min的速度升至200 ℃，保持10 min；进样口温度：250 ℃；检测器温度：250 ℃；载气：高纯氮气，1 mL/min；进样方式：分流进样，分流比10∶1；进样量：1 μL；柠檬烯标准曲线的回归方程为A=1.016 33C-0.172 5，r=0.998 9，A为吸光度，C为柠檬烯的含量，据此计算橘子皮中柠檬烯的含量。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取溶剂的选择

称取6份粉碎的橘子皮样品各2.000 g（每份之间误差不超过5%）置于100 mL闪式提取器中，分别加入10 mL乙醇、丙酮、甲醇、正己烷、三氯甲烷、乙醚、石油醚和6号溶剂油作为溶剂，提取1次，提取时间为1 min，进行闪式提取。提取液按1.3（1）步骤处理，按1.3（3）的气相色谱条件测定，计算柠檬烯得率，每组实验重复3次，取平均值。提取溶剂对柠檬烯得率的影响如图1所示。结果表明，提取溶剂为正己烷时，得率达到最大值。因为柠檬烯类物质是脂溶性强的物质，在烃类、醚类溶剂中溶解效果较好，醇类溶剂提取效率低一些。

图1 提取溶剂种类对柠檬烯得率的影响

2.1.2 料液比的确定

称取6份粉碎的橘子皮样品各2.000 g（每份之间误差不超过5%），置于100 mL闪式提取器中，分别加入体积为2 mL、5 mL、10 mL、15 mL和20 mL的正己烷作为溶剂，提取1次，提取时间为1 min。提取液1.3（1）步骤处理，按1.3（3）的气相色谱条件测定，每组实验重复3次，计算柠檬烯得率，结果如图2所示。结果表明，柠檬烯的提取效率随着正己烷添加量即料液比的增加而逐渐增加，正己烷添加量为10 mL，即料液比1∶5后趋于平缓。

图2 料液比对柠檬烯得率的影响

2.1.3 提取时间的确定

准确称取6份粉碎的橘子皮样品各2.000 g（每份之间误差不超过5%），置于100 mL闪式提取器中，加入10 mL正己烷作溶剂，提取1次，分别控制提取时间0.5 min、1.0 min、1.5 min、2.0 min、2.5 min和3.0 min进行闪式提取。提取液按1.3（1）步骤处理，按1.3（3）的气相色谱条件测定，计算柠檬烯得率，结果如图3所示。

图3 提取时间对柠檬烯得率的影响

结果表明，1 min以前，随着提取时间增加，得率增大，1 min之后，得率随时间的延长不再增加，可能由于随着时间的延长，提取过程产生热量，导致少量的柠檬烯挥发，并且柠檬烯受热更易于氧化，导致得率反而会微弱下降。

2.1.4 提取次数的确定

准确称取6份粉碎的橘子皮样品各2.000 g（每份之间误差不超过5%），置于100 mL闪式提取器中，加入10 mL正己烷作为溶剂，提取时间为1 min，分别提取1、2、3、4、5及6次。提取液按1.3（1）步骤处理，按1.3（3）的气相色谱条件测定，计算得率，结果如图4所示。

图4 提取次数对柠檬烯得率的影响

结果表明，随着提取次数的增加，柠檬烯的得率逐渐增大且趋于平缓。

2.2 正交试验

2.2.1 正交试验设计和结果

为获得橘子皮中柠檬烯的最佳提取工艺条件，根据单因素实验结果，正己烷作为提取溶剂，以柠檬烯含量为考察目标，选取影响橘子皮中柠檬烯提取效率的料液比、提取时间、提取次数，设计3因素3水平正交试验，每个实验条件做3次重复实验，结果取平均值。正交水平因素设计见表1，正交试验结果见表2。

表1 正交水平因素设计

表2 正交试验结果与分析

由表2可知，极差RA＞RC ＞RB，因此影响因素料液比＞提取次数＞提取时间。最佳条件为：A3B3C3，即最佳提取条件为：提取溶剂正己烷，料液比1 ∶ 10（g/mL），提取时间 1.5 min，提取 3 次。

2.2.2 提取工艺验证

按以上最佳工艺条件，用橘子皮样品 2.000 g，重复实验 6 次，柠檬烯得率分别为 2.15%、2.14%、2.11%、2.12%、2.15% 和2.09%，平均值为 2.13%，RSD为 1.14%，证明工艺是可行的。

2.3 结论

本实验通过正交试验得出橘子皮中柠檬烯的最优提取条件为提取溶剂正己烷，料液比1∶10（g/mL），提取时间1.5 min，提取3次，平均得率为2.13%，RSD为1.14%，建立了一种简单、高效的柠檬烯提取工艺条件。