七氟醚、异氟醚降低顺铂诱导的骨肉瘤MG63细胞的凋亡及机制探讨

邹海盯，罗伟

（中南大学湘雅二医院 麻醉科，湖南 长沙 410011）

0 引言

骨肉瘤患者化疗及手术是常用治疗方法，顺铂即顺式-二氯二氨合铂，属于细胞周期非特异性药物，作为一种细胞周期非特异性抑制剂，在骨肉瘤化疗中比较常用。而有研究表明，七氟醚可以增强肺腺癌A549细胞对顺铂化疗敏感性，其与MMP-2、MMP-9、Ezrin和Fascin蛋白表达变化有关[1]。而七氟醚、异氟醚作为骨肿瘤手术常规麻醉药物，其对骨肿瘤化疗敏感性的影响未见有相关文献报道。本研究拟在体外条件下研究七氟醚、异氟醚对骨肉瘤MG63化疗敏感性的影响及初步探索发挥作用可能机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料。骨肉瘤MG63细胞株由第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所提供；顺铂（DDP）购自山东齐鲁制药厂；异氟醚（Isoflurane，Iso）购自鲁南贝特制药有限公司；七氟醚（Sevflurane，Sev）购自美国Baxter公司；DMEM培养基购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司；胰酶细胞消化液购自碧云天生物技术有限公司；MTT、Annexin V-FITC凋亡试剂盒、二甲基亚砜（DMSO）、PS（青霉素+链霉素）自西安国安生物科技有限公司；七氟醚、异氟醚吸入式动物麻醉机购自上海瑞曼信息科技有限公司；96孔板、培养瓶、6孔板、培养皿购自美国COSTAR公司；麻醉气体监测仪购自荷兰Philips公司，流式细胞仪购自美国BD公司；连续波长酶标仪购自瑞士帝肯公司；密闭有机玻璃箱；BCA蛋白定量试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；RIPA裂解液购自西安晶彩生物科技有限公司；免抗Bcl-2、兔抗Bax购自英国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养：将骨肉瘤MG63细胞移至培养瓶中，添加5 mL含10%胎牛血清的培养基，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每隔2～3 d传代一次，1∶2传代。

1.2.2 实验分组与药物处理：对照组，未用药物处理；七氟醚组，2.5%七氟醚作用4 h；异氟醚组，2.0%异氟醚处理4 h；顺铂组，10 mg/L的顺铂处理24 h；七氟醚+顺铂组，10 mg/L的顺铂处理24 h，其前4 h用2.5%七氟醚处理；异氟醚+顺铂组，10 mg/L的顺铂处理24 h，其前4 h2.0%异氟醚处理。药物处理方式：将细胞接种于培养皿或96孔板中，24 h后将细胞放置于有机玻璃箱中，七氟醚或异氟醚挥发罐与其进气口相连，分析七氟醚或异氟醚浓度的气体分析仪与其出气口相连，先打开气体罐（含5% CO2、21 %O2、74 %N2，模拟培养箱中气体成分），将气流调至3 L/min预充3 min，使该混合气体充满密闭容器中，再将流量减至0.5 L/min，打开七氟醚或异氟醚挥发罐，使吸入麻醉药浓度达到上述对应浓度，并维持稳定状态5 min，夹闭进气口和出气口，将密闭有机玻璃箱入于37℃恒温箱中处理4 h，之后取出再置于培养箱中培养，20 h后进行MTT、流式细胞术检测。

1.2.3 MTT检测各组细胞活力：取对数期生长的MG63细胞，制成单细胞悬液，计数并调整细胞浓度为1×104个/mL，接种于96孔板中，每孔加入200 ul，并设7个复孔及1个只加入培养基的空白对照孔。培养24 h后，按各组分别处理。每孔加入5 mg/mL MTT，4 h后用DMSO溶解紫色结晶，在490 nm波长下检测各组的吸光光度值（OD值），并作统计学分析。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡：收集各组细胞，制备成单细胞悬液，固定、染色后用流式细胞仪检测凋亡率。

1.2.5 Western blot检测Bcl-2、Bax表达情况：收集各组细胞，提取蛋白，用BCA法进行蛋白定量并制样。再进行SDS-PAGE电泳，将蛋白转移至PVDF膜上，5%BSA封闭1 h，加入一抗Bcl-2（1:500）和Bax（1:500）4℃杂交过夜，之后二抗常温孵育1h，再用化学发光法检测目的条带。

1.3 统计学处理。采用SPSS 25.0软件进行统计学处理，计量资料采用均数±标准差（±s）表示。OD值、细胞凋亡率、Bcl-2、Bax蛋白表达比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD法（方差齐）或Dunnett’s T3法（方差不齐）。P＜0.05差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组骨肉瘤MG63细胞活力的比较。10 mg/L顺铂作用MG63细胞24 h后，细胞毒性较强（细胞杀伤率为50%，P＜0.05），七氟醚、异氟醚均对MG63细胞的毒性作用微弱（分别为3%和4%，P＜0.05），但与单独使用顺铂组相比，七氟醚或异氟醚联合使用顺铂，细胞毒性反而降低（分别为13%和15%）。提示顺铂、七氟醚、异氟醚对骨肉瘤MG63细胞具有一定的细胞毒性，但七氟醚、异氟醚能减弱顺铂对MG63细胞的毒性作用，见表1。

表1 各组细胞吸光光度值（OD）的比较（±s）

表1 各组细胞吸光光度值（OD）的比较（±s）

注:与对照组相比,＊P＜0.05; 与DDP组相比,﹟P＜0.05。

Group Ctrol 2.5%Sev 2.0%Iso DDP 2.5%Sev+DDP 2.0%Iso+DDP OD 0.98±0.05 0.89±0.05＊ 0.89±0.06＊ 0.37±0.08 0.50±0.02﹟ 0.50±0.03﹟

2.2 各组MG63细胞对顺铂诱导的凋亡率的比较。七氟醚+顺铂组（37.7%）和异氟醚+顺铂组（40.3%）与单纯顺铂组（50.8%）相比，细胞凋亡明显减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）。提示七氟醚和异氟醚能够减弱顺铂对骨肉瘤MG63的细胞毒性，见表2、图1、图2。

表2 各组细胞凋亡率（OR）的比较（±s）

表2 各组细胞凋亡率（OR）的比较（±s）

注:与DDP组相比＊P＜0.05。

Group Ctrol 2.5%Sev 2.0%Iso DDP 2.5%Sev+DDP 2.0%Iso+DDP OR 6.76±0.33 5.66±1.15 5.16±1.14 50.8±2.81＊ 37.7±5.34＊ 40.3±1.96＊

图1 各组细胞凋亡率的比较

图2 流式细胞仪检测细胞凋亡率

2.3 各组骨肉瘤MG63细胞Bax、Bcl-2蛋白表达水平的比较。七氟醚+顺铂组（63%）和异氟醚+顺铂组（63%）与单纯顺铂组（123%）相比，Bax蛋白表达水平降低，七氟醚+顺铂组（22%）和异氟醚+顺铂组（36%）与单纯顺铂组（40%）相比，Bcl-2蛋白表达水平升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。提示七氟醚和异氟醚降低顺铂对骨肉瘤MG63细胞的细胞毒性可能与Bcl-2、Bax有关。见表3、图3、图4、图5。

图4 各组Bax蛋白表达水平与顺铂组相比

图5 各组Bax、Bcl-2蛋白表达

表3 各组MG63细胞Bcl-2、Bax蛋白表达水平的比较（±s）

表3 各组MG63细胞Bcl-2、Bax蛋白表达水平的比较（±s）

Note: ﹟P＜0.01,与DDP组相比，＊P＜0.05,与DDP组相比。

Group Bax Bcl-2 DDP 1.23±0.20 0.22±0.08 2.5%Sev+DDP 0.63±0.12﹟ 0.36±0.08＊2.0%Iso+DDP 0.63±0.13﹟ 0.40±0.12＊

图3 各组Bcl-2蛋白表达水平与顺铂组相比

3 讨论

骨肉瘤是临床常见的原发性恶性骨肿瘤，常见于青少年。70年代以前关节离断和截肢为治疗骨肉瘤主要手段主，5年生存率维持在20%左右。70年代后，化疗联合手术治疗使骨肉瘤患者5年无病生存率超过50%[3-4]。顺铂常用作骨肉瘤患者的化疗。其可抑制肿瘤细胞DNA合成及复制，从而抑制肿瘤细胞增殖并促进其凋亡。近年有国外文献报导，麻醉药可影响顺铂对肿瘤细胞的杀伤作用[5]。国内也有研究发现吗啡可减弱顺铂对人鼻咽癌CNE-2细胞的杀伤作用，其机制可能与吗啡改变Bcl-2、Bax表达相关[6]。又有研究发现七氟醚对艾氏腹水肿瘤细胞有一定的细胞毒性作用，而当七氟醚与顺铂联合应用时，其可减弱顺铂对艾氏腹水肿瘤细胞的细胞毒性作用；而七氟醚可增强顺铂对外周血白细胞、肝细胞、肾细胞的细胞毒性[7]。而梁桦等发现七氟醚可增强顺铂对人肺腺癌A549的杀伤作用。对于麻醉药促进或减弱顺铂对各种细胞的毒性作用，可能与细胞种类有关。

本研究应用七氟醚、异氟醚联合顺铂作用于骨肉瘤MG63细胞，观察七氟醚、异氟醚对顺铂对骨肉瘤mg63细胞毒性的影响，并探讨相关机制。预实验发现当10 mg/L顺铂处理骨肉瘤24 h后可引起50%左右的细胞凋亡，故选用顺铂的浓度为10 mg/L。结合相关文献及前期实验结果，本研究最终决定选择2.5%七氟醚、2.0%异氟醚作为处理骨肉瘤细胞的最终浓度。MTT及流式细胞结果表明，与单纯顺铂组相比，七氟醚联合顺铂及异氟醚联合顺铂组骨肉瘤MG63活力较高，凋亡率较低，提示七氟醚、异氟醚可以降低骨肉瘤MG63细胞对顺铂的化疗敏感性。Bcl-2蛋白家族与细胞凋亡有关其包括Bcl-2、Bax等，其中Bcl-2有抗凋亡作用，Bax有促凋亡作用[8-9]。本研究发现，与单独应用顺铂组相比，七氟醚联合顺铂及异氟醚联合顺铂可上调Bcl-2表达并下调Bax表达。而Bcl-2、Bax表达水平与细胞凋亡密切相关。因此七氟醚、异氟醚降低骨肉瘤MG63细胞对顺铂的化疗敏感性可能与其上调Bcl-2表达和下调Bax的表达有关。

综上所述，七氟醚、异氟醚降低骨肉瘤MG63细胞对顺铂的化疗敏感性，其机制可能与上调Bcl-2及下调Bax蛋白表达相关。后续我们将利用各种生物技术手段研究其具体机制，为临床麻醉药物的选择提供一定的依据。