IL-6 介导JAK/STAT 信号通路在胶原诱导性关节炎大鼠抑郁发生中的作用机制研究①

杨晓珊 王瑞瑞 李 英 曾祥周 （滨州市人民医院风湿免疫科，滨州256610）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以多关节进行性骨破坏、侵袭性滑膜炎为主要特征的自身免疫性疾病。由于RA 病程较长、病情迁延、致残率高，患者易发生焦虑、抑郁等心理疾病，不仅严重降低生活质量，还会导致治疗中断，预后不良［1］。目前临床对RA 伴抑郁相关问题的研究逐渐深入，但其发病机制尚未被完全阐明。Janus蛋白酪氨酸激酶/信号转导及转录激活子（Janus protein ty⁃rosine kinase/signal transducer and activator of tran⁃scription，JAK/STAT）信号通路是重要的细胞因子信号转导途径之一，广泛参与多种疾病病理、生理过程的调节，尤其在调控机体炎症反应中起重要作用，多种细胞因子如IL-6 均是通过该通路发挥生物学效应［2-3］。此外，既往报道显示，RA 伴抑郁患者情绪低落、记忆力及学习能力降低可能与海马结构损伤、突触可塑性改变密切相关［4］。另有研究指出，RA、抑郁患者滑膜及海马组织中均存在大量炎症细胞浸润，通过释放炎症因子参与疾病进程［5-6］。为此，本研究通过建立胶原诱导性关节炎（collagen in⁃duced arthritis，CIA）伴抑郁的大鼠模型，探究IL-6介导JAK/STAT 信号通路在该病进展中的作用及对突触可塑性的影响，有利于揭示RA 伴抑郁发病机制，寻找该病新的治疗靶点。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 56 只 SPF 级 SD 大鼠，雌雄各半，6 周龄，体重（180±30）g，购自上海中医药大学［许可证号：SYXK（沪）2014-0008］。

1.1.2 药物、主要试剂和仪器 牛Ⅱ型胶原、弗氏完全佐剂（complete Freund's adjuvant，CFA）（北京博蕾德生物科技有限公司），水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司），抗IL-6R 单克隆抗体溶液（丽珠医药集团股份有限公司），抗体稀释液（北京诺博莱德科技有限公司），ELISA 试剂盒（上海邦景实业有限公司），乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA），BCA 试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司），兔抗鼠 JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 单抗（美国Abcam 公司），辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体（北京中山金桥生物技术有限公司）。

EG1150 分体式包埋机、RM2265 病理切片机、DM1000 图像分析软件（德国Leica Microsystems 贸易公司），H7500 电子显微镜（日本株式会社日立制作所），DYC-ZY2 转印电泳仪（北京东方瑞利科技有限公司），iBright Imager 凝胶成像分析系统（美国Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型建立 参照文献［7］建立CIA 模型大鼠：10 mg 牛Ⅱ型胶原溶解于0.1 mol/L 的冰醋酸中，将此溶液4℃放置过夜后与等体积CFA 均匀混合，配置成牛Ⅱ型胶原终浓度为1 mg/ml 的混合溶液。采用注射器反复抽吸至混合溶液充分乳化。大鼠采用0.3 ml/100 g 剂量的水合氯醛麻醉后，取该混合溶液注射于大鼠左足底皮下，0.1 ml/只，压迫注射位置使混合溶液完全吸收。健康组以生理盐水代替上述混合溶液，其他操作相同。2 周后左足部、踝关节发红、肿胀，逐渐加重，并蔓延到右后足或前足，提示建模成功。

在CIA建模成功的基础上采用慢性不可预知法建立CIA伴抑郁模型［8］，用禁食24 h、禁水24 h、夹尾1 min、束缚 3 h、4℃ 冰水游泳、45℃ 环境 5 min、160次/min 水平振荡30 min 7种方式刺激，第1天从7 种刺激方式中随机选取1 种，第2 天从剩余6 种方式中随机选取1 种，直至第7 天以此类推，7 种刺激方式每周各进行1 次，连续3 周。大鼠出现主动性活动减少、兴趣缺失、食欲不振为建模成功。

1.2.2 分组及干预方法 取56 只SD 大鼠，适应性喂养7 d 后随机选取10 只设为健康组，其余46 只建立CIA 伴抑郁模型。从CIA 建模成功的37 只大鼠中随机抽取10只设为CIA模型组，其余27只大鼠建立CIA 伴抑郁模型，将CIA 伴抑郁建模成功的22 只大鼠随机分为CIA 伴抑郁模型组、干预组，各11 只。干预组采用抗白介素-6 受体（interleukin-6 receptor，IL-6R）单克隆抗体溶液腹腔注射，剂量40 mg/kg，健康组、CIA 模型组、CIA 伴抑郁模型组腹腔注射等量抗体稀释液。干预组、健康组、CIA 伴抑郁模型组自CIA 伴抑郁模型建模成功后1 d 开始干预，CIA 模型组自CIA模型建模成功后1 d开始干预。将健康组、模型组、干预组大鼠分笼饲喂，自由采食、饮水。

1.2.3 血清IL-6 水平测定 经抗IL-6R 单克隆抗体溶液干预后12 h，按0.3 ml/100 g 腹腔注射水合氯醛麻醉后，健康组、CIA 模型组、CIA 伴抑郁模型组、干预组大鼠腹主动脉取血6 ml。取5 ml 血液2 000/rmin离心15 min（离心半径12 cm），取上清装管，保存于-80℃环境中。采用ELISA 法测定血清IL-6水平，严格按照说明书要求操作，并测定450 nm位置吸光光度值，根据标准曲线计算样本浓度。

1.2.4 组织取材 取血后立即断头处死大鼠，去除颅骨，充分暴露脑组织，掀起两侧顶叶，将海马组织分离并取出。以上操作均在冰盘中进行，并于3 min 内完成。各组取5 只海马组织放置于40%中性甲醛溶液中备用，另取5 只海马组织放置于-80℃保存备用。

1.2.5 海马组织病理变化、突触界面结构观察取40%中性甲醛溶液固定的海马组织，流水冲洗30 min，常规乙醇脱水、石蜡包埋，以病理切片机制作成厚度为5 μm连续切片，HE染色，采用显微镜观察海马组织病理变化，并采用电子显微镜随机摄片（放大20 000 倍），经图像分析软件参考CLIFTON等［9］方法测量海马神经元突触活性区长度、突触后致密物厚度（postsynaptic dlensity，PSD）。测量示意图见图1。

图1 突触活性区长度、PSD测量示意图Fig.1 Schematic diagram of measuring length of synaptic active area and PSD

1.2.6 海马组织JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白相对表达量测定 取保存于-80℃环境中的海马组织，剪碎后加入预冷生理盐水进行匀浆，与0.5 ml RIPA 细胞裂解液混合后进行冰上裂解，10 000/rmin离心15 min（离心半径为8 cm）取上清，经BCA 试剂盒进行蛋白定量。取30 μg样品与等体积上样缓冲液混匀，配制10%分离胶行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。将电泳凝胶进行转膜，转膜后加入封闭液，室温下摇床孵育2 h，加入稀释一抗（1∶1 000），4℃ 孵育过夜，TBST 漂洗3 次，加入辣根过氧化物酶标记的IgG二抗（1∶10 000），常温孵育2 h，TBST 漂洗3 次。暗室中显影，采用凝胶成像系统扫描，分析灰度值，以 JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 蛋白灰度值/内参β-actin 灰度值表示蛋白相对表达量。计算p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3。

1.3 统计学方法 采用SPSS25.0统计学软件分析数据，计量资料以表示，多样本计量资料以方差分析检验，两两样本以LSD-t分析检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 健康组毛发柔顺、光亮，活力旺盛，进食、进水及关节活动正常，CIA 模型组、CIA 伴抑郁模型组左足部发红、肿胀，逐渐加重，且蔓延至右后足或前足，关节难以负重，少数发生溃疡、红斑，CIA 伴抑郁模型组除具有CIA 模型组表现外，另表现为呆滞少动、食欲不振、体重减轻，干预组经过干预上述表现有所改善。

2.2 各组血清IL-6 水平比较 健康组、CIA 模型组、CIA 伴抑郁模型组、干预组血清IL-6 水平分别为（32.82±9.16）pg/ml、（85.23±11.30）pg/ml、（102.62±21.54）pg/ml、（57.43±8.91）pg/ml，组间比较，差异有统计学意义（F=51.071，P<0.001）；CIA 模型组血清 IL-6 水平高于健康组（t=11.394，P<0.001），CIA伴抑郁模型组高于CIA模型组、健康组（t=2.280，P=0.034；t=9.480，P<0.001）；干预组低于CIA 模型组、CIA 伴抑郁模型组（t=6.292、6.430，P<0.001），高于健康组（t=6.238，P<0.001）。

2.3 各组海马组织病理变化情况 通过观察HE染色结果，健康组神经元细胞为椭圆形，胞体饱满、胞质丰富，细胞核圆且大，边缘清晰；CIA 模型组细胞层次减少，结构模糊，细胞带变稀、紊乱、中断，部分神经元细胞发生核固缩、核深染变化，部分细胞核变小或消失；与CIA 模型组比较，CIA 伴抑郁模型组神经元细胞病变更为明显；干预组细胞发生一定程度萎缩，排列较为规则，神经元细胞膜较为完整，少部分细胞萎缩、核固缩。见图2。

图2 各组海马组织病理变化情况（HE染色，×400）Fig.2 Pathological changes of hippocampus in each group（HE staining，×400）

2.4 各组海马突触界面结构变化 电镜观察显示，健康组突触结构清晰、完整，数量多，囊泡均匀且丰富；CIA 模型组突触结构部分溶解，界限较为清晰，突触囊泡多；CIA 伴抑郁模型组突触结构溶解、界限模糊，突触前膜、后膜均不明显，突触小泡破裂或融合；干预组突触数量较CIA 模型组、CIA 伴抑郁模型组增加，结构较为清晰，突触间隙缩小，囊泡多。见图3。

图3 各组海马突触超微结构变化（×20 000）Fig.3 Changes in ultrastructure of hippocampal synapses in each group（×20 000）

2.5 各组海马突触可塑性比较 海马突触PSD、活性区长度组间比较，差异有统计学意义（P<0.05）；CIA 模型组PSD、活性区长度均小于健康组，CIA 伴抑郁模型组小于CIA 模型组、健康组，干预组大于CIA 模型组、CIA 伴抑郁模型组，小于健康组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 各组海马CAI区突触可塑性比较（，nm）Tab.1 Comparison of synaptic plasticity in hippocampal CAI area in each group（，nm）

表1 各组海马CAI区突触可塑性比较（，nm）Tab.1 Comparison of synaptic plasticity in hippocampal CAI area in each group（，nm）

Note：Compared with healthy group，1）P<0.05；compared with CIA model group，2）P<0.05；compared with CIA with depression model group，3）P<0.05.

Active zone length 335.95±52.67 249.75±35.511）201.63±42.851）2）283.36±35.491）2）3）8.967 0.001 Groups Healthy CIA model CIA with depression model Intervention n5 5 5 5 F P PSD 71.25±9.46 51.67±6.891）40.38±5.121）2）62.87±7.031）2）3）16.975<0.001

2.6 各组海马组织p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比较 海马组织p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 比较，差异有统计学意义（P<0.05）；CIA模型组海马组织p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 均高于健康组，CIA伴抑郁模型组高于CIA模型组、健康组，干预组低于CIA 模型组、CIA 伴抑郁模型组，高于健康组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2、图4。

表2 各组海马组织p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相对表达量比较（）Tab.2 Comparison of relative expression levels of p-JAK2/JAK2，p-STAT3/STAT3 protein in hippo⁃campus in each group（）

表2 各组海马组织p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相对表达量比较（）Tab.2 Comparison of relative expression levels of p-JAK2/JAK2，p-STAT3/STAT3 protein in hippo⁃campus in each group（）

Note：Compared with healthy group，1）P<0.05；compared with CIA model group，2）P<0.05；compared with CIA with depression model group，3）P<0.05.

p-STAT3/ STAT3 0.21±0.05 0.50±0.071）0.85±0.081）2）0.35±0.051）2）3）92.873<0.001 Groups Healthy CIA model CIA with depression model Intervention n5 5 5 5 F P p-JAK2/ JAK2 0.24±0.04 0.52±0.061）0.79±0.081）2）0.39±0.041）2）3）82.475<0.001

图4 海马组织JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白免疫印迹图Fig.4 Immunoblot map of JAK2，p-JAK2，STAT3 and p-STAT3 protein in hippocampus

3 讨论

RA 是一种慢性致残性自身免疫系统疾病，主要表现为进行性、对称性多关节炎，最终导致关节畸变、功能丧失，严重影响患者身心健康，甚至引发抑郁症等心理疾患［10］。目前临床在治疗RA 伴抑郁时以药物治疗、心理治疗及联合治疗为主，可在一定程度上减轻患者症状，但用药周期长，患者常因依从性不足而中断或放弃治疗，整体疗效不佳［11］。近年来，随着针对信号转导通路、免疫细胞、促炎因子等分子靶向治疗方式的出现，RA 伴抑郁的治疗已迈向靶向治疗时代。RA 伴抑郁病变组织以自分泌、旁分泌方式释放大量细胞因子，从而介导蛋白质水解、细胞增殖、炎症免疫，参与滑膜及海马组织病变过程。由于绝大部分细胞因子为糖蛋白或多肽，须结合靶细胞表面对应受体，激活相应的信号通路方可具有生物学效应，因此，RA 伴抑郁中细胞因子介导的信号转导通路已成为研究热点。

本研究显示，HE 染色结果中干预组细胞发生一定程度萎缩，与CIA 模型组、CIA 伴抑郁模型组比较，细胞变化不明显，提示下调IL-6 可改善RA 伴抑郁大鼠海马组织病理变化；电镜观察干预组突触数量较CIA 模型组、CIA 伴抑郁模型组增加，结构较为清晰，突触间隙缩小，囊泡多，提示下调IL-6 可改善海马突触界面结构变化；健康组、干预组、CIA 模型组、CIA 伴抑郁模型组的PSD、活性区长度依次减小，提示下调IL-6 可减轻突触可塑性损伤。突触是连接神经元、传递神经信息的关键部位，也是神经可塑性变化的敏感结构。突触可塑性变化是突触形态、功能的改变，目前通常以PSD、活性区长度、间隙宽度及界面曲率等突触界面结构参数作为反映突触可塑性变化的敏感指标［12-13］。IL-6 是由活化T 细胞、单核/巨噬细胞分泌的糖蛋白，可结合可溶性IL-6R 诱导分泌血管内皮生长因子，促使内皮细胞增殖、迁移，导致血管翳形成，在RA 骨与软骨破坏、关节滑膜炎中具有重要作用［14］。IL-6在RA机体中处于高表达状态，可进一步促使脑部胶质细胞、神经元释放激素及神经化学物质，并激发促肾上腺皮质激素释放激素对下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴的调节作用参与抑郁症发生、发展。LI 等［15］研究认为，RA 患者的血清IL-6 水平显著高于健康受试者，RA伴抑郁患者则更高，且血清IL-6水平与抑郁程度呈正相关。本研究通过对CIA伴抑郁模型大鼠注射抗IL-6R 单克隆抗体溶液，海马组织病理变化及突触界面结构变化减轻，PSD、活性区长度增大，表明下调IL-6 可减轻海马组织及突触界面结构变化、突触可塑性损伤。

此外，本研究中，健康组、CIA 模型组、CIA 伴抑郁模型组海马组织p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3依次升高，提示在RA、RA 伴抑郁发病过程中JAK/STAT 信号通路处于激活状态，经IL-6R 抗体干预后，p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 较 CIA 模型组、CIA 伴抑郁模型组降低，但仍低于健康组，说明下调IL-6 后可能进一步抑制JAK/STAT 信号通路，发挥减轻RA伴抑郁突触损伤作用。JAK2属于非跨膜型酪氨酸激酶JAK 家族成员，可介导细胞增殖、免疫功能、造血等多种细胞因子生物学活性，通过结合跨膜细胞因子受体，诱导受体二聚化，启动JAK2 激酶磷酸化，随后招募STAT3，催化STAT3 发生磷酸化［16-17］。活化的STAT3蛋白进入细胞核中结合DNA靶序列，对相应基因表达进行调节，介导细胞因子自胞外向胞内传递的过程。IL-6 与IL-6R 复合物结合于公共转导子gp130 后，可促使与IL-6 偶联的JAK2 激酶互相聚集并磷酸化，从而发挥生物学功能。TIAN 等［18］通过基因沉默技术使 JAK/STAT 信号通路失活，结果显示抑郁模型大鼠脑源性神经营养因子表达上调，从而抑制海马神经元凋亡，减轻抑郁症状，综合两项研究提示可通过阻断JAK/STAT 信号通路减轻抑郁病情。本研究表明IL-6 通过激活JAK/STAT 信号通路，参与调控RF 伴抑郁炎症反应发生、发展，推测针对性阻断JAK/STAT 信号通路可达到减轻抑郁病情的目的。

综上所述，IL-6 介导JAK/STAT 信号通路参与RA 伴抑郁进展过程，推测下调IL-6 阻断JAK/STAT信号通路可改善海马组织病理变化及海马突触界面结构变化，减轻突触可塑性损伤。以IL-6 介导JAK/STAT 信号通路为靶目标可能为RA 伴抑郁的治疗提供新思路。