茶黄素通过调控miR-190 表达对LPS 诱导的结肠上皮细胞炎症损伤的影响①

左灵妮 刘 康 马晓勤 杨雅丽 （甘肃省庆阳市中医医院肛肠科，庆阳745000）

肠道黏膜屏障是肠道的第一道防线，不仅可以将肠道细菌与外界隔离开，还可调节营养吸收和黏膜免疫平衡［1］。肠上皮是一层单层的柱状细胞，位于肠黏膜腔表面，肠上皮细胞的完整性是肠道黏膜屏障的重要组成部分［2-3］。在某些慢性疾病的发展过程中，肠道菌群受到外部因素（例如细菌感染）刺激时发生紊乱，导致黏膜屏障受到破坏，最终引起全身性炎症以及代谢和肠道疾病［1］。因此，维持正常的肠道黏膜屏障对人类健康和生存至关重要。脂多糖（LPS）是一种内毒素，也是一种强促炎症分子，作为革兰氏阴性细菌外膜的主要成分，LPS主要由保守的脂质A和多糖组成［4］。目前，LPS已被证明是影响肠道黏膜屏障功能的关键因素。

天然产物及其衍生物越来越多地用于抵抗人类疾病。茶黄素（theaflavins，TF）是在绿茶发酵成红茶过程中儿茶素类的酶催化氧化二聚作用形成的特征性多酚。近年来，由于茶黄素显示出各种生理作用，如抗氧化剂、抗癌、抗动脉粥样硬化、抗炎、抗病毒、抗牙周炎以及预防骨质疏松的效果，已引起越来越多的关注［5］。研究表明，茶黄素对高糖诱导的人晶状体上皮细胞氧化损伤具有保护作用［6］。在大鼠的气道上皮细胞培养中，茶黄素可减少炎症细胞因子释放［7］。茶黄素对大鼠缺血性脑损伤有一定的预防作用［8］。长度为19～35 个核苷酸的微小RNA（miRNA）已被证实参与肠上皮细胞损伤过程［9］。miR-190 在LPS 诱导的BV2 细胞损伤中下调表达，过表达 miR-190 抑制 LPS 诱导的 BV2 细胞损伤［10］。miR-190 在过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）诱导的心肌细胞损伤中低表达，上调其表达可抑制H2O2诱导的心肌细胞凋亡，减少乳酸脱氢酶（lactate de⁃hydrofenase，LDH）释放和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量［11］。但茶黄素对 LPS 诱导的结肠上皮炎症损伤的影响，以及这一过程是否涉及miR-190 的机制尚不清楚。在本研究中，假设茶黄素可以抵抗LPS 诱导的结肠上皮细胞损伤。为了验证这一推测，本研究以人结肠上皮细胞株NCM460 为研究对象，结合miR-190，探讨茶黄素是否可以改善LPS 诱导的炎症状态和凋亡变化。

1 材料与方法

1.1 材料 茶黄素（含量≥98%，成都普菲德生物公司）；人结肠上皮细胞株NCM460（美国模式菌种收集中心 ATCC）；LPS（美国 Sigma 公司）；miR-190 mimic/inhibitor 及各自阴性对照miR-NC、anti-miRNC（上海 Genepharma 公司）；Lipofectamine 2000、TRIzol 试剂、SuperScript First Strand cDNA 系统（美国Invitrogen 公司）；SYBR Green PCR 试剂盒（中国上海Qiagen公司）；IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA 试剂盒（上海酶联生物公司）；抗B 细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2）抗体、抗Bcl-2相关X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗体、抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体、辣根过氧化物酶偶联的IgG二抗（美国Abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 结肠上皮细胞NCM460 在含10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的RPMI1640 培养基中，于37℃、5%CO2的条件下培养，常规传代。

1.2.2 细胞分组与脂质体转染 将对数生长期的结肠上皮细胞NCM460 分为以下几组：Con 组（对照组，未给予药物处理）、LPS组（给予1 mg/L LPS作用24 h［12］）、LPS+TF-L 组（给予 16 μmo/l L 茶黄素［6］和1 mg/L LPS作用24 h），LPS+TF-M组（给予32 μmo/l L茶黄素和1 mg/L LPS 作用24 h），LPS+TF-H 组（给予64 μmo/l L茶黄素和1 mg/L LPS作用24 h）、LPS+miR-NC 组（转染miR-NC 24 h 后，给予1 mg/L LPS作用 24 h），LPS+miR-190 组（转染 miR-190 mimic 24 h 后，给予 1 mg/L LPS 作用 24 h）、LPS+TF+antimiR-NC组（转染anti-miR-NC 24 h后，给予64 μmo/l L茶黄素和1 mg/L LPS 作用24 h），LPS+TF+anti-miR-190组（转染miR-190 inhibitor 24 h后，给予64 μmo/l L茶黄素和1 mg/L LPS 作用24 h）。转染前1 d，细胞以1×105个/ml接种于6孔板，生长到70%～80%汇合时，根据制造商的方案，使用Lipofectamine 2000 转染质粒，保持6 h。然后用RPMI1640 培养基代替转染培养基，并在37℃下再保持24 h。

1.2.3 ELISA 检测 IL-6、IL-1β 和 TNF-α 表达 收集各组NCM460 细胞上清液，分别遵循IL-6、IL-1β和TNF-α ELISA 试剂盒说明书操作步骤，测定炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α表达。

1.2.4 流式细胞术评估细胞凋亡 通过膜联蛋白V（Annexin V）-异硫氰酸荧光素（FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）双重染色法测定结肠上皮细胞NCM460 的凋亡率。收获不同处理的NCM460 细胞，收集 5×105个细胞，将其悬浮于500 μl 结合缓冲液 Binding Buffer 中，并依次加入 5 μl Annexin VFITC 和PI。在黑暗中孵育15 min 后，通过FACS Calibur流式细胞仪分析细胞凋亡。

1.2.5 Western blot 分析Bcl-2和Bax 蛋白表达 将结肠上皮细胞NCM460在RIPA 裂解缓冲液中裂解，提取总蛋白。在10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）中分离40 μg 蛋白，然后转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。将印迹用5%脱脂牛奶封闭1 h，并与Bcl-2、Bax、GAPDH 一抗在4℃ 孵育过夜。然后将膜用辣根过氧化物酶偶联的IgG 二抗在室温下再孵育2 h。蛋白条带通过ECL Plus 检测系统可视化。使用Image J 软件进行图像定量，以GAPDH为对照，分析Bcl-2蛋白和Bax蛋白的表达。

1.2.6 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）测定miR-190 表达 经过不同处理后，收集细胞，TRIzol 试剂提取总RNA。根据说明书，使用SuperScript First Strand cDNA 系统将 2 μg 总 RNA 反转录为 cDNA。将该cDNA 用作模板并进行定量PCR。采用SYBR Green PCR 试剂盒在ABI PRISM 7700系统上进行定量分析。用 2-ΔΔCt法计算 miR-190 表达，U6 用作内部对 照 。 miR-190 和 U6 引 物 序 列 参 照 SUN 等［13］的报道。

1.3 统计学分析 使用SPSS22.0软件分析统计数据信息。所有数据均显示为。两组间数据的比较采用t检验，多组数据间的比较采用单因素方差分析，组间多重比较使用SNK-q检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 茶黄素对LPS 诱导的结肠上皮细胞炎症因子表达的影响 图1 结果显示，与Con 组比较，LPS 组结肠上皮细胞 NCM460 中炎症因子 IL-6、IL-1β 和TNF-α表达水平显著升高；与LPS组比较，LPS+TF-L组、LPS+TF-M 组和LPS+TF-H 组明显降低结肠上皮细胞 NCM460 中炎症因子 IL-6、IL-1β 和 TNF-α 的表达水平，且随茶黄素浓度的增加，3 种炎症因子的表达逐渐降低（P<0.05）。

图1 茶黄素对LPS 诱导的结肠上皮细胞炎症因子表达的影响Fig.1 Effect of theaflavins to LPS-induced colon epithelial inflammatory factor expression

2.2 茶黄素对LPS 诱导的结肠上皮细胞凋亡的影响 图2 结果显示，与Con 组比较，LPS 组结肠上皮细胞NCM460 的凋亡率明显增加，Bcl-2 蛋白表达水平明显降低，Bax 蛋白表达水平明显升高；与LPS 组比较，LPS+TF-L 组、LPS+TF-M 组和 LPS+TF-H 组结肠上皮细胞NCM460 的凋亡率明显减少，提高Bcl-2蛋白表达水平，降低Bax蛋白表达水平，且随茶黄素浓度的增加，细胞凋亡率和Bax蛋白表达逐渐降低，Bcl-2蛋白表达渐渐升高（P<0.05）。

图2 茶黄素对LPS诱导的结肠上皮细胞凋亡的影响Fig.2 Effect of theaflavins on apoptosis of colonic epithelial cells induced by LPS

2.3 茶黄素对LPS 诱导的结肠上皮细胞中miR-190表达的影响 图3结果显示，与Con组比较，LPS组结肠上皮细胞NCM460 中miR-190 表达水平显著降低；与 LPS 组比较，LPS+TF-L 组、LPS+TF-M 组和LPS+TF-H 组明显提高结肠上皮细胞NCM460 中miR-190 的表达水平，且随茶黄素浓度的增加，miR-190的表达逐渐增强（P<0.05）。

图3 茶黄素对LPS 诱导的结肠上皮细胞中miR-190 表达的影响Fig.3 Effects of theaflavins on expression of miR-190 in colonic epithelial cells induced by LPS

2.4 miR-190 过表达对LPS 诱导的结肠上皮细胞炎症因子表达的影响 图4 结果表明，与LPS+miRNC 组比较，LPS+miR-190 组结肠上皮细胞NCM460内miR-190 表达量明显增加，炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α表达水平明显降低（P<0.05）。

图4 miR-190过表达对LPS诱导的结肠上皮细胞炎症因子表达的影响Fig.4 Effect of miR-190 overexpression on expression of colonic epithelial inflammatory factors induced by LPS

2.5 miR-190 过表达对LPS 诱导的结肠上皮细胞凋亡的影响 图5 结果发现，与LPS+miR-NC 组比较，LPS+miR-190 组结肠上皮细胞NCM460 的细胞凋亡率明显减少，Bcl-2蛋白表达水平明显升高，Bax蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。

图5 miR-190过表达对LPS诱导的结肠上皮细胞凋亡的影响Fig.5 Effect of miR-190 overexpression on apoptosis of colonic epithelial cells induced by LPS

2.6 抑制miR-190 表达逆转了茶黄素（64 μmol/L）对LPS 诱导的结肠上皮细胞炎症损伤的作用 图6结果显示，与LPS+TF+anti-miR-NC 组比较，LPS+TF+anti-miR-190 组明显降低结肠上皮细胞NCM460中 miR-190 表达，显著提高炎症因子 IL-6、IL-1β、TNF-α 的表达水平和细胞凋亡率，并明显降低Bcl-2蛋白表达水平，显著提高Bax蛋白表达水平（P<0.05）。

图6 抑制miR-190 表达逆转了茶黄素对LPS 诱导的结肠上皮细胞炎症损伤的作用Fig.6 Inhibition of miR-190 expression reversed effect of theaflavins on LPS induced inflammatory injury of colonic epithelial cells

3 讨论

LPS 是强大的细菌致病因子，当肠道环境紊乱时，LPS 可通过脱落或细菌裂解从细菌细胞壁释放出来，并作为肠道炎症反应的有效激活剂，影响肠道上皮细胞功能［13］。为了治疗肠道疾病并减轻患者的痛苦，研究人员正在寻找抗LPS 的有效天然产物。茶黄素是红茶中存在的主要活性多酚，包括茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3′-没食子酸酯和茶黄素-3-3′-没食子酸酯，具有显著的抗炎效果［14-15］。因此，本研究试图探讨茶黄素对LPS 感染过程中结肠上皮细胞的保护作用和分子机制。

当前的研究通过评估与炎症和凋亡状态有关的生物学指标，探讨了茶黄素对LPS 诱导的结肠上皮细胞损伤的保护作用。既往研究表明，LPS 会诱导促炎症细胞因子表达并最终引起炎症［16］。TNF-α是一种细胞信号蛋白（细胞因子），可诱导凋亡性细胞死亡和炎症，TNF-α表达失调与多种疾病有关，主要在肠道中引起炎症性肠病［3］。IL-1β、IL-6 是与炎症相关的关键介质。资料显示，茶黄素给药减少了LPS 处理的小鼠中 TNF-α 和 IL-1β 含量，并抑制经LPS 处理的人小胶质细胞中促炎细胞因子TNF-α 的产生，从而抑制活化的小胶质细胞的神经毒性作用［17］。茶黄素可减少大鼠结扎诱导的实验性牙周炎中IL-6 的分泌［18］。与这些研究一致，本实验的数据显示，LPS 处理24 h 后显著提高了结肠上皮细胞炎症因子 IL-6、IL-1β、TNF-α 表达。而细胞给予16 μmo/l L、32 μmo/l L、64 μmo/l L 的茶黄素处理后，LPS 诱导的促炎因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）的表达被抑制，且这种抑制作用随茶黄素作用浓度的增加而逐渐提高。这些结果表明，茶黄素在对抗LPS诱导的肠上皮细胞炎症反应方面具有良好的潜力。

大量研究已证实，LPS 可诱导炎症反应，甚至诱导细胞凋亡和自噬［19-21］。凋亡是程序性细胞死亡的一种形式，对正常细胞存活十分重要。凋亡是一个活跃的过程，涉及许多基因的激活、表达和调控［22］。Bcl-2 和Bax 属于Bcl-2 基因家族，在细胞凋亡中起关键作用。Bcl-2成员位于线粒体中，具有促凋亡功能（Bax）或抗凋亡功能（Bcl-2）［23］。先前的研究表明，LPS 诱导的组织损伤（如肠道损伤）伴随着凋亡细胞的增加［24］。茶黄素处理下调了胃黏膜上皮细胞GES-1 中乙醇损伤诱导的Bax 和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）表达水平，上调Bcl-2 表达水平，可以通过调节细胞凋亡来保护GES-1细胞免于乙醇损伤［25］。本实验数据表明，LPS刺激24 h可显著增加细胞凋亡率。LPS显著上调结肠上皮细胞中Bax 蛋白表达，下调Bcl-2 蛋白表达，而茶黄素则抵消了这些LPS诱导的效果。提示茶黄素通过抑制促凋亡蛋白Bax 表达，促进抗凋亡蛋白Bcl-2 表达而减弱LPS 诱导的结肠上皮细胞凋亡，与前人报道相符［23］。为了探索茶黄素对抗LPS的潜在机制，本研究观察到不同浓度的茶黄素可以促进miR-190 表达，且促进作用随茶黄素浓度的增加而逐渐增强。提示茶黄素对LPS损伤的结肠上皮细胞的治疗作用与其调节miR-190基因的能力有关。

同时，本实验发现LPS 可下调miR-190 表达。在不同癌症中，miR-190 的作用已得到广泛探讨［26-28］。最近的研究表明，miR-190 影响心脏缺血/再灌注和帕金森病［10-11］。目前尚未建立miR-190 与非癌性结肠疾病之间的关系。因此，这项研究应用了不同的miR-190 质粒来帮助理解miR-190 在LPS诱导的炎症和凋亡损伤中的作用。据报道，在LPS诱导的 BV2 细胞中，miR-190 下调；当 miR-190 过表达时，LPS 诱导的BV2 细胞中促炎介质（如iNOS、IL-6、TNF-α 和TGF-β1）的表达受到抑制，抗炎性介质（如IL-10）增加，且miR-190 的上调抑制了LPS 诱导的BV2 细胞凋亡［10］。这一结果与本项研究结果相符，一方面，miR-190 过表达可抑制LPS 诱导的结肠上皮细胞中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α 的表达，另一方面，miR-190 过表达降低LPS 诱导的结肠上皮细胞凋亡率、Bax 蛋白表达，并显著提高Bcl-2 蛋白表达水平。这表明miR-190 过表达可减轻LPS 诱导的结肠上皮细胞炎症反应和凋亡，从而发挥一定的保护作用。此外，抑制miR-190表达后，茶黄素抑制LPS 诱导的结肠上皮细胞中 IL-6、IL-1β、TNF-α 表达、细胞凋亡率、Bax蛋白表达的作用，以及促进Bcl-2蛋白表达的作用被逆转。这些结果说明，茶黄素保护结肠上皮细胞免受LPS 损伤的功能机制与调控miR-190有关。

总之，本研究的结果强调了茶黄素是改善结肠上皮细胞损伤的有效天然产物。由于其显著的抗炎和抗凋亡能力，茶黄素有效地保护结肠上皮细胞免受LPS 诱导的伤害。并且，茶黄素的功能是通过调控细胞中miR-190的表达来实现的。以上结果表明，茶黄素可能是预防与LPS 相关的肠道疾病的有效治疗剂。