复发缓解型多发性硬化患者血清miR-326表达水平与NSE、MBP水平变化的关系①

谢 阳 袁正洲 刘梦兰 罗思维 李作孝 （西南医科大学附属第一医院神经内科，泸州646000）

多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是一种通过免疫介导的中枢神经系统（central nervous system，CNS）白质的慢性炎性脱髓鞘为主要病变特点的疾病，它最常见的类型是复发缓解型（RR），该病的病因及发病机制尚不明确，但MS 作为一种自身免疫性疾病主要依赖于淋巴T细胞介导的观点已得到认可，这些活化的T 细胞可直接进入CNS 破坏髓鞘及神经元轴突等重要结构，从而导致MS 的发生发展，而髓鞘碱性蛋白（MBP）和神经元特异性烯醇化酶（NSE）作为神经元损害及髓鞘脱失的特异性分泌因子在疾病的进展中发挥着重要的作用［1-2］。而微小RNAs（miRNAs）是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，有部分研究提出中枢神经系统的miRNAs 有潜在的免疫诱导作用，可以通过靶向效应对免疫系统中的信号转导分子产生影响参与类风湿性关节炎（RA）、系统性红斑狼疮（SLE）等多种自身免疫性疾病的发生发展［3］。这可能与高表达的miR-326 可以抑制靶基因产物Ets-1（一种调节Th17 分化的负性因子）的表达，T 淋巴细胞的活化，促进炎症细胞因子的释放损害髓鞘及神经元等结构，从而加重自身免疫性疾病患者病情有关［4］。但关于RRMS 患者miR-326 的表达情况与NSE、MBP的关系目前报道较少，所以本研究通过对RRMS 患者miR-326 水平的变化及其与NSE、MBP 之间的关系分析，探究miR-326 在RRMS 中的作用，并为MS的发病机制研究提供更多新的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床资料 收集西南医科大学附属医院神经内科2017 年8 月至2020 年4 月期间就诊收治的复发缓解型MS 患者59 例（RRMS 诊断符合多发性硬化诊断与治疗的中国专家共识［5］），其中RRMS 急性期组 33 例，男 10 例、女 23 例，年龄 21～58 岁，平均（35.47±6.23）岁；RRMS 缓解期组26 例，男8 例、女18 例，年龄 20～56 岁，平均（36.72±5.21）岁。入组标准：①各组患者的临床资料均完整；②已完善头颅和全脊髓MRI 检查；③各组患者均知情同意并签署了知情同意书；④意识清晰，能完成配合研究者。排除标准：①有严重的心肺肝肾等脏器病变；②合并恶性肿瘤者；③有严重的感染和意识障碍而不能配合研究者；④有其他自身免疫性疾病者。

同步收集性别、年龄与RRMS 急性期和缓解期组相匹配的 30 例健康体检者，男 10 例、女 20 例，年龄22～58 岁，平均（36.49±5.27）岁。所有的研究对象和家属均签署知情同意书，同时本临床研究通过了西南医科大学附属医院伦理委员会的批准。

1.1.2 试剂 ELISA试剂盒购自美国R&D Systems公司；Trizol LS 购自美国 Invitrogen 公司；M-MLV 逆转录试剂盒购自中国TIANGEN 公司；miRNA 荧光检测试剂盒购自德国QIAGEN公司。

1.2 方法

1.2.1 血清样本收集 所有受检者在清晨抽取5 ml 静脉血，在室温中自然凝固15 min，4 000/rmin离心5 min，取出上层血清放在-80℃超低温冰箱内进行存放，采用ELISA 法检测各组外周血清中NSE、MBP的表达水平。

1.2.2 纯化miRNA 和总RNA 将抽取的静脉血从-80℃冰箱取出，Ficoll 分离液将血浆进行分层，具体操作如下：所取样本融化后加入Trizol LS混匀并进行振荡，再将0.5 ml 氯仿加入混匀，低温离心机10 000/rmin 离心10 min，取上清液并加用miRNeasy液，按miRNeasy 快速试剂盒说明书的相关步骤提取总 miRNA。将提取的 miRNA 放入 30 μl 的 DEPC 水中56℃水浴15 min加速RNA的溶解。

1.2.3 RT-PCR 检测 提纯后的miRNA 使用MMLV 的逆转录试剂盒完成第一链cDNA 合成，并使用miRNA 荧光检测试剂盒，采用SYBR Green 嵌合荧光法的原理完成miRNA 荧光定量检测。以上的操作过程均按照相关试剂盒说明书进行，反应体系为 20 μl，引物设计使用 Primer 5.0 软件完成，具体的引物序列为5'-CCUCUGGGCCCUUCCUCCAG-3'，定量PCR 的反应条件为95℃ 下处理5 min，然后95℃变性10 s，再经退火和延伸60℃36 s，重复进行40 个循环。所有的数据使用ABI 7300 SDSvl. 2x System 软件进行处理，依靠软件的自动分析功能获取相应的Ct 值，将U6 作为内参基因，外周血清中miR-326的相对含量差值为2-ΔΔCt，单样品进行3次的测定后软件分析获取出相应Ct平均值。

1.2.4 外周血清中MBP、NSE 的检测 按照ELISA试剂盒的具体操作说明检测各组外周血清MBP、NSE的表达水平。

1.3 统计学处理 采用SPSS20.0对所有数据进行分析，计量资料以表示，均数间的两两比较采用t检验，并采用Pearson 检验对变量间的关系进行相关性分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组一般资料的比较 各组患者在性别、年龄及合并基础疾病的一般资料对比中均无明显差异（P>0.05），见表1。

表1 各组一般资料的比较Tab.1 Comparison of general data for each group

2.2 各组外周血清中miR-326、NSE 及MBP 的水平表达 由表2 可以看出，无论在RRMS 的急性期组还是缓解期组，miR-326相对表达量和NSE、MBP的表达水平均显著高于健康对照组（P均<0.05），而与缓解期组进行比较，RRMS急性期组患者miR-326相对表达量及NSE、MBP的表达也都明显增高（P均<0.05）。

表2 各组外周血清miR-326、NSE及MBP的表达情况（）Tab.2 Expression of miR-326，NSE and MBP in periph⁃eral blood of each group（）

表2 各组外周血清miR-326、NSE及MBP的表达情况（）Tab.2 Expression of miR-326，NSE and MBP in periph⁃eral blood of each group（）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with RRMS remission group，2）P<0.05.

MBP（μg/ L）miR-326NSE（μg/ L）Groups Control（n=30）RRMS acute（n=33）RRMS remission（n=26）1.23±0.366.34±2.014.82±1.32 4.86±0.751）2）55.68±17.291）2）47.05±16.281）2）2.45±0.481）28.51±12.341）23.69±9.321）

2.3 RRMS 急性期及缓解期血清miR-326 水平与NSE、MBP的相关性分析 由表3可以看出：RRMS患者缓解期组外周血清中miR-326水平与NSE、MBP均呈正相关关系（r分别为0.742和0.693，P均<0.05），而急性组miR-326的相对表达量与NSE、MBP也呈正相关关系（r分别为0.821和0.716，P均<0.05）。

表3 RRMS两组患者血清miR-326水平与NSE、MBP的相关性分析Tab.3 Correlation analysis between serum miR-326 level and NSE，MBP in two RRMS groups

3 讨论

MS 作为一种以中枢神经系统的髓鞘脱失为主要特点的炎症自身免疫性疾病，研究普遍认为它属于自身免疫性疾病，但确切的病因和发病机制尚不清楚。而固有免疫和适应性免疫应答参与了MS 疾病的发生发展这一说法得到了公认。而近期越来越多的证据表明，miRNA 能通过靶向效应对免疫系统中重要的相关信号转导分子表达产生影响［6］。而表观遗传学的研究发现某些miRNA 表达的异常与MS、SLE 及RA 等自身免疫性疾病的发生存在联系，它可能通过影响T 细胞、B 细胞及巨噬细胞的分化和激活而调控免疫效能，这可能与MS 的发病启动有关联［7-9］，毕竟CD4+T 细胞介导的免疫失调被看作为导致MS 发病的重要因素。其中高表达的miR-326 可以抑制靶基因产物Ets-1（一种调节Th17 分化的负性因子）的表达，从而加重自身免疫性疾病患者的病情［4］，研究表明在MS患者的外周血淋巴细胞中出现miRNA-326 的表达与Th17 细胞的分化存在着明显的正相关关系，并在CD4+T 细胞中也通过荧光原位杂交的方法检测到miRNA-326 与IL-17A 之间的共表达现象，这对于了解MS 的发病机制及对预后的判断具有非常重要的临床指导意义［10-11］。本临床研究中也发现在RRMS缓解期和急性期时外周血中miR-326 水平均显著高于健康对照组，而急性期中升高的更加明显，说明miR-326参与了MS的发生发展。

众所周知，自身免疫性T 淋巴细胞对机体有直接靶向攻击作用。研究发现，多种自身免疫性疾病中可能存在一些特异性T细胞直接攻击髓鞘及神经元，造成神经元内细胞的钙水平显著升高，最后这些结构出现不可逆转的坏死［12-13］。可见在MS 等疾病进展过程中，通过驻留在中枢神经系统内的自身免疫性T淋巴细胞不断地激活活化并释放出大量的炎症细胞因子而直接对神经元及髓鞘等结构造成严重损害，导致病情的进一步加重［14］。作为特异性的神经内分泌因子，NSE 在正常稳定状态下特异性地存在于神经内分泌细胞及神经元中，作为糖酵解关键酶维持着神经元的生理功能及稳定；而MBP 则是参与中枢神经系统中髓鞘构成的一种特异性碱性蛋白，它与髓鞘的脂质之间紧密结合，对CNS 髓鞘的功能与结构稳定发挥着重要作用［15-17］。当髓鞘甚至神经元发生损害后，NSE 及MBP 可从细胞内迅速进入到细胞间隙，进而通过受损的血脑屏障进入到外周血中，所以NSE、MBP 是作为反映CNS 中神经元损害的客观指标［18］。

本研究发现RRMS患者无论急性期组还是缓解期组比较于健康对照组都存在NSE 及MBP 水平的高表达，以急性期组更为明显，这说明RRMS患者存在着髓鞘及神经元的损害，并且在疾病复发急性期时损害程度更严重，而将上述两指标与miR-326 的相对表达量行相关性分析后得出RRMS患者两组的miR-326 水平与NSE、MBP 的表达均呈正相关关系。说明miR-326可能通过免疫介导造成髓鞘及神经元损伤而参与了RRMS的发生发展。推测其机制可能与miR-326 通过调节CD4+T 淋巴细胞的活化，并释放大量的炎性细胞因子，从而直接对MMRS 患者的中枢神经系统中的髓鞘及神经元进行攻击造成损害，导致NSE 和MBP 迅速通过受损血脑屏障进入外周血中有关［19］。

综上所述，RRMS 患者的外周血清中miR-326的表达水平显著升高，以急性期更明显，且miR-326的水平表达与NSE、MBP 均呈正相关关系，但有关MS 发病与miR-326 之间的具体机制，目前尚不清楚，仍然需要进一步的研究探索。