CD94_rs2302489和NKG2A 基因多态性与类风湿性关节炎易感性和预后的关系

李 静 高 鹏 王淑云 刘宇宏 霍爱鑫 （延安大学附属医院风湿免疫科，延安 716000）

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种全身性自身免疫性疾病，疾病晚期可能出现关节畸形和功能障碍，严重危害人类健康［1］。RA 病因复杂，内源性或环境因素均可触发遗传易感个体自身免疫反应，导致疾病进展［2］。据估计，至少50%RA发病风险由遗传因素决定［3］。RA 发病机制尚未明确，研究表明，自然杀伤（nature kill，NK）细胞和T 细胞均参与RA 发生发展［4-5］。以上细胞功能（包括细胞毒活性和细胞因子释放）由NK细胞和T细胞各受体传导的抑制和激活信号平衡调节。

NK 细胞和T 细胞的效应反应可通过CD94/NKG2 分子进行调节，CD94/NKG2A 是 NK 细胞和 T淋巴细胞亚群上表达的抑制性受体，可识别呈递标准HLAⅠ类衍生肽的非经典MHCⅠb类人白细胞抗原 E（HLA-E）配体［6］。表达 HLA-E 的细胞与 NK 细胞的主要相互作用是HLA-E 与CD94/NKG2A 抑制受体间的反应［7］。CD94/NKG2A-HLA-E 通路可诱导一系列抑制信号，从而抑制NK 细胞毒活性和细胞因子产生。

CD94/NKG2A 受体影响 NK 细胞和 T 细胞调节并参与自我耐受维持，其调节缺陷可能同时影响先天和适应性免疫应答，导致自我耐受和自身免疫反应崩溃。因此，这些分子可能RA 发展的重要促进因素。目前，CD94/NKG2A 多态性鲜有研究，因此，本研究探究CD94/NKG2A 多态性对RA 易感性的潜在影响，并评估CD94/NKG2A 多态性与抗TNF 治疗预后的关系。

1 资料与方法

1.1 资料 选取 2016 年 12 月至 2018 年 12 月我院接受治疗的RA患者290例，我院体检中心体检的健康受试者130 例，所有患者均符合2010 年美国风湿病学会（ACR）/欧洲风湿病联盟（EULAR）制定的RA 分类标准，抗TNF 治疗前，疾病活动度评分（DAS28）>5.1，且至少对2 种疾病修饰型抗风湿药物（DMARDS）治疗无效。本研究经我院伦理审查委员会批准，参与知情同意。排除标准：①肝、肾功能严重受损者；②除RA 外还伴有其他全身性结缔组织疾病者；③患有糖尿病未得到控制者。

1.2 方法

1.2.1 患者一般信息评价 评估基线及抗TNF 治疗后第12 周和第24 周患者临床特征，采用DAS28评分评估患者疾病活动，根据EULAR反应标准评估临床反应。反应良好：和基线相比，ΔDAS28>1.2，且DAS28≤3.2；中度反应：ΔDAS28>1.2，且DAS28>3.2，0.6<ΔDAS28≤1.2，且 DAS28≤5.1；无反 应 ：ΔDAS28≤0.6，0.6<ΔDAS28≤1.2，DAS28>5.1（表1）。

表1 患者临床特征［，n=290，例（%）］Tab.1 Patients characteristics［，n=290，n（%）］

表1 患者临床特征［，n=290，例（%）］Tab.1 Patients characteristics［，n=290，n（%）］

Note：CRP.C-reactive protein；RF.Rheumatoid factor；anti-CCP. Anticyclic citrullinated peptide antibodies.

51.52±11.54 226（77.9）12.63±8.21 39.32±12.32 6.45±0.72 24.35±35.56 191（65.9）277（95.5）150（51.7）124（42.8）266（91.7）270（93.1）Clinical characteristics Age（year）Female Disease duration（year）Disease onset（year）DAS28 at baseline CRP at baseline RF positive Anti-CCP+Anti-TNF drugs Etanercept Adalimumab Glucocorticosteroids Methotrexate

1.2.2 单核苷酸多态性（SNPs）选择和基因分型 采用文献及SNPinfo 网站获得的功能预测，选择CD94 和NKG2A 基因内的多态性。EDTA 抗凝管采集受试者外周血，根据说明书采用DNA 纯化试剂盒提取DNA。采用实时PCR LightSNiP 分析技术测定CD94（rs2302489）、NKG2A（rs7301582、rs2734440、rs2734414）多态性，采用LightCycler 480实时PCR系统进行反应。

1.3 统计学分析 采用R3.0.2软件进行统计学分析。群体遗传学包评估基因型频率的Hardy-Wein⁃berg 平衡，Fisher 精确检验比较患者和对照组等位基因、基因型和单倍型频率，Fisher 精确检验评价SNPs 对抗 TNF 治疗的影响，PHASE CD94 和 NKG2A基因的4个SNPs组合进行单倍型重建，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD94、NKG2A 基因型和等位基因在 RA 患者和健康对照组中的分布 RA 患者和对照组基因型频率与Hardy-Weinberg平衡模型预测的基因型频率一致。CD94 多态性与RA 风险相关，与对照组相比，患者CD94 AA 基因型频率显著降低（OR=0.43，95%CI：0.21～0.89，P=0.025），与 AA 纯合子相比，CD94 TT 基因型在患者中占主导地位（OR=1.98，95%CI：0.94～4.22，P=0.042，表 2），患者和对照组未观察到其他SNPs相关性。

表2 CD94和NKG2A等位基因、基因型和单倍型在RA患者和健康对照组中的分布［例（%）］Tab.2 Distribution of CD94 and NKG2A alleles，genotypes and haplotypes in RA patients and healthy control［n（%）］

2.2 RA 患者CD94/NKG2A 基因多态性与抗CCP抗体的关系 抗CCP 抗体阳性RA 患者CD94 TT 基因型频率明显高于抗CCP抗体阴性患者（OR=8.76，95%CI：1.19～387.50，P=0.034，图 1）；相反，CD94 AA 纯合子在抗CCP抗体阴性患者中更为常见（OR=11.29，95%CI：2.38～52.26，P=0.002）。此外，等位基因A 与抗CCP 抗体阴性显著相关（OR=5.01，95%CI：1.87～14.95，P=0.003）。

图1 CD94 rs2302489多态性与抗CCP抗体存在的相关性Fig.1 Association of CD94 rs2302489 polymorphism with presence of anti-CCP

2.3 CD94 和 NKG2A 基因多态性对抗TNF 治疗临床结局的影响 CD94 A等位基因与抗TNF治疗12周及24 周后更好的EULAR 反应显著相关（OR=1.91，95%CI：0.98～3.66，P=0.038，OR=1.64，95%CI：1.07～2.52，P=0.016，表 3）。24 周 EULAR 反应良好患者中，CD94 AA 基因型频率显著升高（OR=3.07，95%CI：0.97～11.44，P=0.039）。与其他基因型的患者相比，CD94 TT 基因型患者12 周后缓解率较低（OR=3.31，95%CI：0.07～0.89，P=0.020）。

表3 第12周和第24周EULAR反应与CD94和NKG2A多态性的关系［例（%）］Tab.3 Relationship of EULAR responses at 12 and 24 weeks with CD94 and NKG2A polymorphisms［n（%）］

此外，抗TNF 治疗临床结局与NKG2A rs7301582多态性相关。与其他基因型患者相比，携带NKG2A rs7301582 C 等位基因患者及NKG2A rs7301582 CC 基因型患者12 周后无反应更为常见（OR=3.67，95%CI：1.13～18.94，P=0.015，OR=3.59，95%CI：1.02～19.42，P=0.028）。此外，与纯合子患者相比，NKG2A rs2734440 AG 基因型患者12 周后 EULAR 良好/中度反应更为频繁（OR=3.26，95%CI：1.11～11.63，P=0.024），与其他基因型患者相比，NKG2A rs2734440 AA基因型携带者一般治疗无效（OR=2.79，95%CI：1.05～7.98，P=0.025）。对NKG2A rs2734414 进行的分析未能证明与EULAR反应显著修改。

2.4 CD94/NKG2A 单倍型分析 共鉴定出12个单倍型，本研究选择其中6 个最常见的单倍型（TTCA、ATCA、TATG、TTCG、ATCG 和AATG）进一步分析，RA 患者与对照组所选单倍型频率差异无统计学意义，仅有1 种TATG 单倍型在RA 患者中比对照组更为常见（OR=1.97，95%CI：1.10～3.64，P=0.021，表2）。

3 讨论

本研究表明，RA 易感性可能与CD94 多态性有关。RA 患者CD94 rs2302489 AA 基因型频率显著低于对照组。CD94 多态性也影响RA 患者抗TNF治疗临床疗效。CD94 AA 基因型患者更易缓解，而CD94 TT 基因型在EULAR 反应较差的患者中更为普遍。表明AA 基因型可能保护机体免受RA 发展侵袭，疗效更好，而TT 基因型有益于RA 发展，且对抗TNF 治疗反应更差。研究表明，中国受试者中，T等位基因与白塞病风险降低相关，但这种效应仅观察于等位基因水平，并未与易感性相关基因型相关［8］。

本研究发现，RA 患者抗TNF 治疗的临床结局与NKG2A 多态性相关。NKG2A rs2734440 AA 基因型在抗TNF 治疗无反应患者中更为丰富，且与治疗无效相关，但其基因型在患者和健康对照组间分布无差异，与关于NKG2A rs2734440多态性的研究（自身免疫性疾病的易感性）结果矛盾。中国患者中，NKG2A rs2734440 AA 基因型与白塞病风险显著增加和RA 风险降低相关［8-9］。研究差异可能反映不同地区、不同环境因素的遗传异质性，或可能由于样本量相对有限导致。

CD94 和 NKG2A 在 RA 易感性和调节抗 TNF 药物反应机制尚未阐明。CD94 rs2302489（UTR-5 区域，包含1 个可能的转录因子结合位点）及NKG2Ars7301582和rs2734440（内含子区域）多态性可能影响转录或选择性剪接产生不同产物，部分可能有助于RA 发病或干扰抗TNF 治疗［10］。但这些假设需要进一步遗传和功能研究，以阐明这些多态性在RA发病机制中的作用。

考虑到CD94/NKG2A 受体的作用，体外观察显示，CD94/NKG2A 阻断抗体存在下，TNF-α 和 IFN-γ产量增加，说明CD94/NKG2A 可能在调节炎症细胞因子产生中发挥作用［11］。另外在新发牛皮癣患者中观察到NK 细胞上CD94/NKG2A 受体表面表达降低［12］。说明CD94/NKG2A受体下调可能阻止CD94/NKG2A 介导的NK 细胞对表达HLA-E 的靶细胞的抑制并影响活化受体和抑制受体平衡。NK 细胞过度活化反过来诱导NK 细胞介导的靶细胞裂解及过度促炎细胞因子产生，有助于疾病发生和发展。此外，CD94/NKG2A 受体也与系统性红斑狼疮（SLE）发病有关，与对照组相比，这些分子在患者T细胞上表达减少［13］。关于RA 的发病机制，已有研究表明，与活动性疾病相比，缓解的RA 患者CD94/NKG2A受体在T 细胞上的表达升高［14］。综上，可以假设由CD94/NKG2A 抑制信号下调引起的NK 和T 细胞活化不足可能导致自身耐受性下降，免疫细胞向自身组织侵袭并导致自身免疫反应。

总之，本研究证明CD94 基因多态性可能是RA易感性的潜在候选基因，是第一个涉及CD94/NKG2A 多态性对RA 患者抗TNF 治疗功效的研究，需要进一步研究其多态性在RA发病机制中的作用。