一种快速检测水产品中孔雀石绿及其代谢物的方法研究

邓艳芹,汪坤乾,邱 收,梁 翰

(武汉农业检测中心，湖北 武汉 430016)

孔雀石绿(malachite green, MG)是一种带有金属光泽的绿色结晶体,不仅作为一种工业性染料,还因为价格低廉且具有杀真菌的作用,曾被广泛用于水产养殖上.孔雀石绿属三苯甲烷类,能引起动物肝脏组织、肾、心脏、披、肺、眼睛、皮肤等脏器和组织中毒,且在动物组织中残留性较高.在动物脏器中,孔雀石绿还能通过生物转化,还原代谢成脂溶性的隐色孔雀石绿(leucomalachite green, LMG),具有高毒性、高残留和致癌、致畸、致突变作用.这些含有孔雀石绿及其代谢物残留的水产品被食用后,会严重威胁人类身体健康[1].由于缺乏有效的替代物以及利益驱使,孔雀石绿的违禁使用仍然时有发生.

作为全面开展水产品食品安全监管的项目之一,如何快速和准确地检测孔雀石绿是各大检测机构普遍关注的问题.目前,采用液质联用仪方法对孔雀石绿及其代谢物进行检测是常用的检测手段[2-4].日常监测中,通常采用GB/T19857-2005水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定[5]中推荐的方法进行检测,但是该方法步骤繁琐,且经过了多次转移、定容以及氮吹操作,导致回收率不稳定,对操作人员专业性要求较高.本研究旨在研究如何应用液质联用仪快速准确地对水产品中孔雀石绿进行检测,以满足日常快速检测水产品的要求.

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

乙腈(CH3CN,色谱纯,美国J.T.Baker公司);甲醇(CH3OH,色谱纯,美国J.T.Baker公司);中性氧化铝柱(ANPEL, 500 mg/3 mL);50 mL聚乙烯离心管;乙酸铵(优级纯);甲酸(色谱纯);孔雀石绿及隐色孔雀石绿纯度>95%,购自北京农业部环境保护科研监测所;孔雀石绿-D5和隐色孔雀石绿-D6分别作为内标，购自北京农业部环境保护科研监测所;氯化钠(NaCl,分析纯).

高效液相色谱-串联质谱联用仪(Thermo quantum access,赛默飞世尔科技有限公司,ESI源);旋涡震荡仪(XH-D);超声仪(20 kHz～40 kHz);分析天平(精确到百分位).

1.2 实验方法

本研究做了以下几组对照试验.

提取剂乙腈添加体积为25 mL和10 mL两组对照.首先作为对照,按照国标法,添加乙腈体积为25 mL,分取10 mL净化后,氮吹并定容到2 mL.接着,本方法采用减少乙腈体积至10 mL进行对比.即称取5.00 g样品后,加入10 mL乙腈,添加3 g氯化钠后,涡旋振荡3 min,超声30 min,12000 r/min离心3 min.取1.5 mL进行过中性氧化铝柱净化,并上机.通过添加5.0 μg/kg、10.0 μg/kg、20.0 μg/kg三个不同浓度梯度,每个梯度三个平行,比较两种方法的操作难易程度及回收率.

添加NaCl和不添加NaCl对照试验.对6个草鱼样品添加浓度为20 μg/kg的孔雀石绿和隐色孔雀石绿,分为添加NaCl和不添加NaCl两个样品组,每组三个平行,其他实验操作保持一致,进行回收实验对比.

净化方法选择对比.对6个草鱼样品添加浓度为20 μg/kg的孔雀石绿和隐色孔雀石绿进行回收对比试验.采用乙腈提取和添加NaCl并离心的方法,吸取上清液作为提取液.将进行提取操作后的6个平行样分为两组,每组各三个平行.第一组的净化方法是将1.5 mL提取液通过氧化铝柱进行净化.第二组是按照国标方法,将氧化铝柱用5 mL乙腈活化后,加入1.5 mL提取液通过氧化铝柱.对两组样品的回收率进行对比.

国标和本研究方法检测流程及精确度对比.对6个草鱼样品添加浓度为1.0 μg/kg的孔雀石绿和隐色孔雀石绿进行对比试验.将6个样品分为2组，每组三个平行.分别采用国标GB/T 19857-2005水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定和本研究方法进行回收试验.从检测流程和精确度两方面进行对比.

本研究方法实验过程如下.样品选取市场上常见水产品品种有草鱼、鲫鱼、鲈鱼、黄颡鱼、小龙虾,参照国标进行制备.称取5.00 g样品于50 mL离心管中,分别放入20 μL 1 μg/mL内标溶液3 g NaCl、10.0 mL乙腈.高速涡旋振荡3 min,超声波仪器中超声30 min.然后10000 r/min离心3 min.取约1.5 mL上清液放入事先架在进样瓶上的中性氧化铝柱中.等待净化液流入到样品中,上机检测.液相及质谱条件参照文献[5].

作为对比,称取5.00 g样品于50 mL离心管中,放入20 μL 1 μg/mL内标溶液,加入11 mL乙腈，超声波振荡提取2 min，8000 r/min匀浆提取30 s，4000 r/min离心5 min，上清液转移至25 mL比色管中，另取一50 mL离心管加入11 mL乙腈，洗涤匀浆刀头10 s，洗涤液移入前一离心管中，用玻璃棒捣碎离心管中的沉淀，旋涡混匀器上振荡30 s,超声波振荡5 min,4000 r/min离心5 min,上清液合并至25 mL比色管中，用乙腈定容至25.0 mL，摇匀备用.移取5.00 mL样品溶液加至用5 mL乙腈活化的中性氧化铝柱，接收流出液，并用4 mL乙腈洗涤中性氧化铝柱，收集全部流出液，45℃旋转蒸发至约1 mL，残液用乙腈定容至1.00 mL，超声波振荡5 min,加入1.0 mL 5 mmol/L乙酸铵，超声波振荡1 min,样液经0.2 μm滤膜过滤后供液相色谱-串联质谱测定.

本研究同时进行了其他水产样品包括虾以及各种鱼的添加回收试验.采用国标法对市面上的水产品进行筛查,筛选出不含孔雀石绿及隐色孔雀石绿的草鱼、鲫鱼、鲈鱼、黄颡鱼、小龙虾样品.在这些阴性样品中添加1.0 μg/kg、2.0 μg/kg和4.0 μg/kg的孔雀石绿及隐色孔雀石绿,每个样品每个浓度三个平行.再采用优化后的实验方法对这些样品进行回收率和精密度检测.

1.3 数据统计及分析

利用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析,采用方差分析进行差异显著性检验(α=0.05).

2 结果

2.1 提取剂乙腈体积的选择

比较添加不同体积提取剂乙腈的两组样品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿的回收率,可以发现,国家标准需要氮吹,耗时较长且多次转移,造成孔雀石绿提取时损失较大.表1为不同提取体积的样品回收率的比较结果.结果显示,本方法不需要氮吹,且提取净化时间较短,孔雀石绿及其代谢物的回收率都能得到满意的结果.虽然国标的提取方法也能得到良好的回收率和重复性,但是考虑到能节省溶剂,减少提取时间,本方法具有更好的适用性.

表1 乙腈不同添加体积的样品回收率

2.2 是否添加NaCl

通过比较添加NaCl和不添加NaCl两组样品的回收率发现,孔雀石绿的回收率没有显著差异(P>0.05).但是,不添加NaCl组中隐色孔雀石绿平均回收率只有10%,与添加NaCl组的回收率值达到显著差异(P<0.05)，结果见表2.

表2 添加NaCl和不添加NaCl对照组的样品回收率

2.3 净化方法的选择

以国标净化方法进行比对,本实验采用中性氧化铝柱直接进行净化.检测两组采用不同净化方法的样品中的孔雀石绿及其代谢物浓度,对比发现两组样品的回收率平均值没有显著差异(P>0.05)，结果见表3.

表3 不同净化方法对照组的样品回收率

2.4 国标法和本研究方法的对比

分别采用文献[5]中方法和本研究方法进行回收试验.从精确度和检测流程两方面进行对比，结果见表4.

表4 两种检测方法精确度及检测流程的比较

2.5 回收率和精密度

原标准GB/T 19857-2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》中,采用液质联用仪测定法时孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿的方法检出限均为0.5 μg/kg.采用本实验方法对不同样品进行回收试验,计算回收率及相对偏差(反映精密度),结果如表5.本实验中孔雀石绿及其代谢物的回收率在72%～105%之间,孔雀石绿回收浓度的相对偏差小于13,隐色孔雀石绿回收浓度的相对偏差小于10,满足实验要求.

表5 水产品中孔雀石绿及隐色孔雀石绿回收率和精密度

3 讨论

国标方法中提取体积为25 mL,分取5 mL净化后定容至2 mL,稀释倍数为2.本方法提取体积为10 mL,取适量提取液直接过氧化铝净化柱后上机检测,稀释倍数也为2.实验发现提取体积10 mL对孔雀石绿和隐色孔雀石绿的回收率没有显著影响(P>0.05).由于孔雀石绿和隐色孔雀石绿极易溶于乙腈,考虑到节省溶剂和氮吹时间,以及减少多次转移造成回收损失,本方法采用10 mL提取液效率更高,快速筛查时适用性更好.

本实验同时考察了是否添加NaCl对回收率的影响,发现添加NaCl能显著提高隐色孔雀石绿的回收率(P<0.05).欧阳燕玲[6]和朱程云[7]等采用QuEChERS 方法提取隐色孔雀石绿具有较好的回收率,但孔雀石绿的回收率较低,只有68.7%～72.3%.原因是部分孔雀石绿的提取效果不好或者发生了转化.本实验发现采用添加NaCl的方法,不仅能较好地去除一些水溶性杂质,同时通过使水相和有机相分层后,减少水分子在过氧化铝柱时与氧化铝发生水合反应,对孔雀石绿和隐色孔雀石绿产生吸附,提高了孔雀石绿和隐色孔雀石绿的提取效果.

本实验同时比较了是否活化氧化铝柱对孔雀石绿及其代谢物的回收产生影响,数据分析显示没有显著差异(P>0.05).这可能是因为氧化铝柱中的氧化铝不需要活化即可对脂肪具有较好的吸附性[8],而孔雀石绿及其代谢物因为在乙腈中良好的溶解性,被乙腈带出净化柱,从而不会影响其回收率.

综上,相比国标,本实验的有机溶剂用量减少.同时,因为本实验没有采用氮吹的过程,使得检测时间大大缩短,也减少了孔雀石绿及其代谢物在多次转移氮吹过程中的损失.回收率和精密度实验结果显示,孔雀石绿及其代谢物的回收率在72%～105%之间,孔雀石绿回收浓度的相对偏差小于13,隐色孔雀石绿回收浓度的相对偏差小于10.本实验对不同样品进行了实际检测,回收率和精密度均能满足要求.该实验方法准确、简便、快速,满足高通量筛查的工作要求.