枸杞果胶酯酶基因LbPME克隆及表达分析

李浩霞 尹跃 杨斌 安巍 赵建华

摘要：以宁夏枸杞（Lycium barbarum L.）'宁杞1号'果实为材料，利用RT-PCR技术，克隆出LbPME的全长序列为1 152 bp，包含完整的开放阅读框（ORF），编码有384个氨基酸，蛋白质分子量为42.63 ku，理论等电点9.20;LbPME编码的蛋白包含2个可能的N-糖基化结合位点（Asn46和Asn183），4个底物结合位点（Thr166、Gln201、Arg301和Trp303）和2个酶活性位点（Asp224和Asp245）。分析发现，该蛋白由多个呈右手螺旋的β折叠肽链组成，且含有1个中空三角柱状的PME经典结构;LbPME与茄科的烟草的同源性达到90.86%。利用实时荧光定量技术，发现不同组织中LbPME均有表达，且在茎中最高而叶中最低，两者存在显著差异;随着果实的发育，LbPME表达量呈现出先升后降趋势，在青果期表达量最高，随后显著降低，在成熟期维持较低水平。本研究结果为进一步探讨枸杞LbPME的功能奠定了基础。

关键词：枸杞;果胶酯酶基因;克隆;表达

中图分类号： S188  文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2021）18-0033-06

收稿日期：2021-01-05

基金项目：国家自然科学基金（编号：32060359）;宁夏自治区科技创新领军人才项目（编号：KJT2017004）;宁夏自治区农业科技自主创新专项（编号：NKYJ-18-16）。

作者简介：李浩霞（1977―），女，甘肃景泰人，副研究员，主要从事旱作农业及栽培生理研究。E-mail：lihaoxia0943@163.com。

通信作者：赵建华，博士，副研究员，主要从事枸杞种质遗传改良与分子生物学研究。E-mail：zhaojianhua0943@163.com。

果胶酯酶又称果胶甲酯酶（pectin methylesterase，简称PME），是细胞壁代谢的关键酶之一，PME催化果胶分子去甲酯化后易与钙离子结合，使细胞壁硬化，延缓细胞的生长;同时，PME在去甲酯化过程中，释放大量氢离子，形成低pH值的胞外环境，聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶活性增强，造成果胶大量降解，促进细胞加快生长[1-2]。在柑橘、香蕉、苹果、葡萄、胡萝卜、番茄、马铃薯、豌豆等植物中均有关于PME的报道[3]。拟南芥PME基因仅在花粉中特异表达，缺失该基因会造成花粉管形态异常及种子数减少[4]，而拟南芥PME基因的表达受丁香假单胞杆菌番茄致病变种的诱导，当植株受到病菌侵染时，该基因表达量大幅上升[5]。豌豆根尖PME基因的表达与根边缘细胞的游离紧密相关，该基因表达会抑制根边缘细胞的正常游离[6]。休眠状态的黄杉种子未检测到PME的活性，但逐渐增加外源PME浓度，会引起种子休眠的破坏和萌发[7]。随着樱桃的果实果肉的软化，PME活性逐渐增高[8]。此外，通过QTL分析筛选出3个果胶酯酶参与番茄果实抗坏血酸含量的调控[9]。在转CbPMEI1和PMEI13基因拟南芥中，PME参与低温和盐胁迫下根系生长调控[10]。因此，PME在植物生长发育、种子萌发和果实软化等过程中发挥着重要作用[11]。

PME广泛存在于高等植物中，目前已从柑橘[12]、棉花[13]、草莓[14]、番茄[15]、枇杷[16]等中分离出PME基因。拟南芥PME基因在花和荚果整个发育阶段均有不同程度的表达[17]。研究发现，PME基因大多以基因家族的形式存在[18-19]，水稻有59个编码基因，拟南芥有66个编码基因，白杨有89个编码基因[20-22]，但目前有关于枸杞PME的研究国内还尚未见到报道，本研究以宁夏枸杞'宁杞1号果实为材料，基于枸杞果实转录组测序数据，克隆出枸杞果实中LbPME的 cDNA 全长，并分析枸杞果实发育各个时期LbPME的表达特征，为进一步研究枸杞LbPME基因的功能及枸杞生长代谢机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为宁夏枸杞'宁杞1号'品种，均采自宁夏银川市西夏区芦花台园林场国家枸杞种质资源圃（106°9′ E、38°380′ N，海拔1 100 m），选取6年生'宁杞1号'树3棵，于2018年6―7月，在果实发育的幼果期（开花后约9 d）、青果期（开花后约15 d）、色变期（开花后约22 d）、初熟期（开花后约29 d）和成熟期（开花后约36 d），分别选取果粒大小均匀、果色一致的无病虫害的果实;在果实成熟期采集枸杞根、茎、叶和果实，所用材料用液氮迅速冻结后，运送回国家枸杞工程中心分子生物学实验室后立即放置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及反转录 采用Trizol 试剂盒（北京TIANGEN公司）提取枸杞果实的总RNA，利用RT-PCR试剂盒（美国ThermoFisher公司）对提取的总RNA进行反转录，获得单链cDNA，用于后续LbPME的克隆及表达分析。

1.2.2 目的基因克隆 依据转录组所获得的EST序列，设计全长引物：LbPME-F和LbPME-R（表1）。以枸杞果实反转录cDNA为模板，扩增目的基因LbPME的全长序列。PCR反应体系：2×PCR Buffer 25 μL，dNTP （2 mmol/L） 10 μL，LbPME-F （10 μmol/L） 2 μL，LbPME-R （10 μmol/L） 2 μL，cDNA 模板1 μL，KOD FX Neo（1 U/μL，Toyobo Life Science Cat）1 μL，Millipore H2O补足50 μL。PCR反应程序：98 ℃预变性5 min;98 ℃变性 10 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸2 min，共30个循环;68 ℃延伸5 min。PCR擴增产物克隆到pMD18-T载体（德国TakaRa公司）上进行测序。

1.2.3 实时荧光定量表达分析 根据LbPME序列设计荧光定量引物LbPME-qRTF和LbPME-qRTR（表1），以18S基因为内参基因，在BIO-RAD CFX ConnectTM 荧光定量 PCR 仪中进行扩增。反应体系：Power SYBR Green PCR Master Mix （Applied Biosystems Cat）12.5 μL，LbPME-qRTF（10 μmol/L）1 μL，LbPME-qRTR（10 μmol/L） 1 μL， cDNA模板5 μL， Millipore H2O补足25 μL。内参基因18S使用的实时荧光定量PCR引物为 18S-F2 和18S-R2。反应条件：95.0 ℃预变性 3 min;循环为95.0 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸20 s，75 ℃读板5 s，共40个循环;溶解曲线从65 ℃上升到95 ℃， 每次读板上升0.5 ℃。通过计算2-ΔΔCT值來确定该基因的相对表达量。

1.2.4 生物信息学分析 利用DNAman软件对LbPME全长进行相应氨基酸序列分析;利用ProtParam tool（http：//web.expasy.org/protparam/）完成蛋白基本性质分析;采用PSORT Prediction（http：//psort1.hgc.jp/form.html）完成亚细胞定位分析;使用NCBI Conserved Domains（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/docs/cdd_search.html）对序列的结构域和功能进行分析;使用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org）进行蛋白质三级结构预测分析;在NCBI网站运行的Blast程序数据库中对LbPME氨基酸序列进行相似性搜索，并进行了聚类分析;利用MEGA7软件中提供的比对功能进行多序列比对并基于邻接法（Neighbor-joining method，NJ）构建系统进化树bootstrap系数为1 000次，进化距离计算采用泊松校正方法。

2 结果与分析

2.1 枸杞LbPME基因克隆分析

基于转录组测序数据分析，发现TR12421|c0_g1的EST基因在果实发育过程中FRKM值呈现出显著差异。以该EST序列设计特异性异物，从枸杞果实中获得枸杞果胶酯酶基因片段（图1）。该片段测序长度为1 152 bp（图2）。经Blast比对发现，该序列与果胶酯酶同源，暂时命名为LbPME，NCBI注册号为KX584484。

2.2 枸杞LbPME基因氨基酸序列及进化树分析

测序结果如图2所示。该基因含有1个1 152 bp 的开放阅读框，编码有384个氨基酸，其理论等电点和分子量分别为9.20和42.63 ku，该基因的氨基酸序列分子式为C1 957H2 954N512O533S14，包含25个碱性氨基酸（Asp+Glu）和36个酸性氨基酸（Arg+Lys）。消光系数为58 370，吸光系数为1.369。脂肪酸系数为77.68，不稳定系数为28.40，是一个较稳定的蛋白。

对其结构域进行分析，结果表明，该蛋白在Ser37～Ile381位氨基酸序列与果胶酯酶结构域（PLN02682）有较高相似性，其E值为0e+00。由图3可见，该蛋白具有果胶酯酶的显著特征，在LbPME蛋白序列中发现有2个可能的N-糖基化结合位点（Asn46和Asn183），4个底物结合位点，分别是Thr166、Gln201、Arg301和Trp303，2个酶活性位点Asp224和Asp245，以及1个疑似的过渡态稳

定位点Gln223（未在图上标示）。对其进行三级结构预测，LbPME由多个β折叠呈现右手螺旋排列，形成中空的三角形柱状果胶酯酶经典结构，其中一侧为底物结合与催化位点。无规卷曲形成了4个底物结合位点（Thr166、Gln201、Arg301和Trp303），这4个位点形成一个四边形结构。

采用PSORT Prediction（http：//psort1.hgc.jp/form.html）对LbPME蛋白进行亚细胞定位，结果表明，该酶有可能是一种分泌在细胞外蛋白，并结合到细胞壁上发挥其功能。利用Blast比对分析，LbPME与茄科的同源性最高，与烟草的同源性达到90.86%。利用MEGA7软件，构建果胶酯酶氨基酸序列的系统发育树（图4），枸杞LbPME与茄目物种烟草、辣椒、马铃薯、牵牛花聚类到一个分枝，并与真子叶菊分支的其他2个目（唇形目和菊目）果胶酯酶聚类到一个大分枝上;但与真子叶蔷薇分支物种的果胶酯酶完全分离。此外，蔷薇分支物种樱桃与桑树完全聚类到不同的2个分枝中;但亲缘关系较远的金虎尾目胡杨与无患子目柑橘却聚到一起。这也说明果胶酯酶在植物进化过程中既具有很好的保守性，又在物种间呈现出少量变异。

2.3 枸杞LbPME基因表达特征分析

通过qRT-PCR 分析发现，枸杞植株根、茎、叶、果实等组织器官中的LbPME均有表达，其中，茎中表达量最高，果实中次之，叶中最低，且茎中表达量显著高于其他3个组织器官（图5-A）。随着枸杞果实发育，果实中LbPME呈现出先升后降的变化趋势（图5-B），在青果期表达量达到最大， 随后显著降低，在果实成熟时表达量维持较低水平。在果实发育的幼果期和成熟期枸杞LbPME表达量较低，且2个发育期表达量无显著差异，但显著低于其他3个时期，可见，枸杞LbPME在果实发育青果期到初熟期表现得更为活跃，但在果实成熟时可能由于细胞壁发育趋于稳定，LbPME表达量降低。

3 结论与讨论

自Balestrierii等从猕猴桃克隆出第1个PME基因后[23]，对植物PME基因的研究愈加深入。 植物天然PME分子量一般在15～36 ku[9]，如胡萝卜34.5 ku[24]，大豆33 ku[25]，脐橙36.2 ku[26]。在本研究中，成功克隆出枸杞LbPME全长为1 152 bp，包含1个完整的开放阅读框（ORF），编码383个氨基酸，其理论等电点和分子量分别为9.20和42.63 ku。而在枇杷中分离出2个EjPPME1和EjPPME2基因，均包含1个1 737 bp的开放阅读框（ORF），共编码578个氨基酸，EjPPME1理论等电点为8.94，理论分子量为63.05 ku，EjPPME2理论等电点为9.04，理论分子量为63.12 ku[16]。可见，不同植物PME蛋白分子存在一定差异，这可能是PME基因大多以基因家族的形式存在的缘故[18-19]。进一步对枸杞LbPME蛋白的三级结构域分析发现，该蛋白具有PME的显著特征，由多个呈右手螺旋的β折叠的肽链排列而成，并且形成中空三角柱状的PME经典结构，这与胡萝卜、番茄的PME三维结构基本相似[27-28]。

PME是细胞壁代谢的关键酶之一，主要作用是催化植物细胞壁中的果胶去甲酯化，生成果胶酸和甲醇，进而调控植物的生长发育。PME广泛存在于高等植物中，其表达存在时空差异特性，一些PME基因在整个植株的生命周期能持续表达[29]。但也有一些PME基因只在植株生长发育的特定阶段或特定的组织器官中表达。在草莓上发现，FaPE1仅在果实中表达，FaPE2仅在叶中表达，FaPE3-4在整个植株中均有表达[15]。在本研究中，LbPME在整个植株均有表达，其中，在茎中的表达量最高，在叶中的表达量最低。随着果实不断发育，果实中LbPME表达量呈现出先升后降变化趋势，在整个发育阶段青果期表达量最高，幼果期最低，这与草莓果实发育过程中PME基因变化趋势基本一致。这就表明LbPME在枸杞果实发育的青果期发挥重要作用，但随着果实不断发育，LbPME的表達量逐渐降低，在果实成熟时维持着较低表达水平，其参与枸杞果实细胞壁成熟表达水平明显减弱，但LbPME在果实发育过程中参与果实细胞壁合成调控还有待于进一步研究。

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