基质金属酶9 在HPV 阴性喉鳞状细胞癌中的表达特征

李增宏，廖烈强，周 舸，庞艺施，何子键，陈伟雄

（佛山市第一人民医院耳鼻咽喉头颈外科1，麻醉科2，广东 佛山 528000）

喉恶性肿瘤（laryngeal cancer）是发病率仅次于口腔恶性肿瘤的最常见的头颈恶性肿瘤[1]，其发病率逐年上升[2]。超过90%的喉恶性肿瘤的病理类型为鳞状细胞癌[2]。随着医学技术的不断发展以及人民对生活质量要求的不断提高，喉癌的治疗目标已不仅仅在于保证生存率，喉功能的保留也日益受到关注[3]。鉴于此，提高喉癌的早期诊断率及探寻改进喉癌的综合治疗策略，成为了业界的研究热点。癌症和肿瘤基因图谱计划（the cancer genome atlas，TCGA）的研究表明，人类乳头状瘤病毒（human papillomavirus，HPV）对于头颈恶性肿瘤的分子信号通路具有决定性的调控作用[4]。前期研究发现[5]，喉鳞状细胞癌的HPV 感染率极低，提示针对喉鳞状细胞癌的发生发展机制研究更应着重于HPV 阴性喉鳞状细胞癌的相关分子信号通路的研究。基质金属酶（matrix metallopeptidase，MMP）是一组锌离子依赖性内肽酶，可调控细胞基底膜的降解，从而促进肿瘤细胞的侵袭、迁移[6]。其中，MMP-9 参与降解细胞基底膜的主要成分——Ⅳ型胶原蛋白，在调控肿瘤细胞转移尤其是上皮细胞间充质转变（epithelial-mesenchymal transition，EMT）中发挥着关键作用[7]。研究表明[8]，MMP-9 与喉癌细胞远处转移密切相关。然而，目前尚未有研究指出MMP-9 在HPV 阴性喉鳞状细胞癌中的表达情况及作用机制。本研究旨在探明MMP-9 在HPV 阴性喉鳞状细胞癌中的临床表达特点，探讨其应用于早期诊断、预后评估及改善疗效的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2016 年1 月-2020 年12 月佛山市第一人民医院收治的喉鳞状细胞癌患者的临床数据及组织标本，共计109 例。本研究已获佛山市第一人民医院伦理委员会批准，入选患者均签署同意书。上述病例均获得病理证实，活检前均未接受手术治疗或放、化疗等治疗。获得组织标本后将其保存于-70 ℃超低温冰箱中。

1.2 DNA 及RNA 提取 在低温环境下将分别研磨喉癌肿瘤标本及对应癌旁正常组织。研磨后一部分组织按照Promega 公司的Wizard®gnomic DNA purification kit 的说明书流程提取组织DNA。首先在研磨后的组织中加入细胞核裂解液及RNA 酶溶液混合，在37 ℃水浴中放置30 min。其后取上清液并加入100%异丙醇使DNA 沉降，并以70%的乙醇清洗2次以洗脱异丙醇。DNA 沉降物风干后，加入DNA 水化溶液，放置于4 ℃冰箱过夜，制成DNA 溶液。剩余组织按照Invitrogen 公司的TRIZOL 的说明书流程提取组织RNA。首先在研磨后的组织中加入1 ml的TRIZOL 试剂，室温下放置5 min。加入0.2 ml 氯仿至标本混合液后摇匀，在37 ℃水浴中放置3 min，离心使混合液分层，取上清液与0.5 ml 异丙醇混合，在室温下放置10 min，离心获得RNA 沉淀，以1 ml的75%乙醇洗涤2 次。风干RNA 沉淀后以无核酸酶水重新溶解制成RNA 溶液。提取所得的组织DNA及RNA 标本存放于-70 ℃超低温冰箱中。

1.3 HPV DNA 检测 按照Qiagen 公司的Digene HC2 HPV DNA test 试剂盒的说明书流程检测组织标本中的HPV DNA[9]。配平组织标本DNA 浓度后，将标本DNA 样本分别加入96 孔板的微孔中，加入HPV 特异性探针试剂与样本混合，利用DML2000型二甘醇微板光度计读取样本的HPV DNA 的相对荧光信号值（relative light units，RLUs），并与生产商提供的阳性对照标志物的RLU 值进行比较。当标本的RLU 值高于阳性对照标志物的RLU 值时，标本被定义为“HPV 阳性”；当标本的RLU 值低于阳性对照标志物的RLU 值时，则被定义为“HPV 阴性”。

1.4 cDNA 逆转录及RT-PCR 检测 配平组织标本RNA 浓度后，按照Life technologies 公司的High-Capacity cDNA conversion kit 的说明书流程，将组织样本的RNA 中加入随机引物、逆转录缓冲液、逆转录酶、四种三磷酸脱氧核苷、RNA 酶抑制剂，逆转录为cDNA。利用Roche 公司的LightCycler®480 对cDNA 进行RT-PCR 检测。反应程序：第一阶段：95 ℃10 min；第二阶段：95 ℃15 s 后60 ℃1 min，共45轮。以GAPDH 作为内参基因，计算MMP-9 cDNA的相对表达量。

1.5 观察指标 分析HPV 阴性喉鳞状细胞癌中MMP-9 的表达特点，肿瘤组织及癌旁正常组织中MMP-9 的表达差异，比较MMP-9 表达与患者吸烟、饮酒、TNM 分期的关系。

1.6 统计学分析 利用SPSS 16.0 软件对上述数据进行统计学分析，计数资料采用（n，%）表示，比较采用χ2检验；利用Wilcoxon Signed Rank test 分析肿瘤组织及癌旁正常组织中MMP-9 的表达差异。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者临床资料及HPV 感染状况 患者大多为男性，长期吸烟史者较多，声门型癌占比较高，其次为声门上型癌，未见声门下型癌病例，病例以T3、T4期为主，患者均呈HPV 阴性，见表1。

表1 患者临床资料及HPV 感染状况[n=109，n（%）]

2.2 MMP-9 在HPV 阴性喉鳞状细胞癌中的表达情况109 例患者中，55 例患者MMP-9 呈高表达，54 例为低表达，其中不同年龄、吸烟、饮酒状况及临床分期的HPV 阴性喉鳞状细胞癌患者MMP-9 表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；而颈部淋巴结转移的HPV 阴性喉鳞状细胞癌的MMP-9 表达高于无颈部淋巴结转移患者，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2；MMP-9 在肿瘤组织中的表达与癌旁正常组织比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 MMP-9 在HPV 阴性鳞状细胞癌中的表达

表2 MMP-9 在HPV 阴性鳞状细胞癌中的临床特点[n（%）]

表2 （续）

3 讨论

HPV 感染已被证明是头颈鳞状细胞癌的重要致病因素[10]。TCGA 研究表明[4]，在HPV 阳性头颈恶性肿瘤及HPV 阴性头颈恶性肿瘤之间，肿瘤信号调控通路具有明显差异。相较于HPV 阳性的头颈恶性肿瘤，HPV 阴性的头颈恶性肿瘤对放化疗的敏感度更低，预后更差[11]。本研究针对HPV 阴性喉癌的发生发展机制进行研究，以期为喉癌尤其是HPV 阴性喉癌的早期诊断及精准治疗提供理论基础。在众多肿瘤信号调控通路中，EMT 相关通路对肿瘤恶性程度具有决定性作用[12]，并与肿瘤复发、放化疗抵抗等密切相关[13，14]。鉴于此，对HPV 阴性喉癌的EMT相关通路上的关键位点进行调控，对于改善喉癌的预后具有重大意义。

MMP-9 属于Ⅳ型基质金属酶，通常以无活性的前体存在于体内，被激活后可分解细胞基底膜的主要成分——Ⅳ型胶原蛋白以及明胶、层粘连蛋白、弹性纤维蛋白、原纤维蛋白、聚蛋白多糖等，使肿瘤细胞突破基底膜屏障，进入血液及淋巴循环系统，并重塑肿瘤细胞的微环境，促进肿瘤细胞完成侵袭、迁移[15]。研究表明，MMP-9 的高表达在早期喉癌便可测得[16]，并与喉癌淋巴结转移、临床分期呈正相关[17]，在喉癌的EMT 相关通路中扮演关键角色[8]，且与喉癌患者的5 年生存率呈负相关[18]。然而，目前尚无研究指出MMP-9 在HPV 阴性恶性肿瘤中扮演的角色。本研究结果显示，MMqP-9 在HPV 阴性喉鳞状细胞癌中呈高表达。结合MMP-9 的高表达可在喉癌早期便可测得这一特点，MMP-9 有望作为HPV 阴性喉鳞状细胞癌的早期诊断标志物。另外，MMP-9 的高表达与HPV 阴性喉鳞状细胞癌肿瘤细胞的淋巴结转移呈正相关，提示MMP-9 在HPV 阴性喉鳞状细胞癌的发生发展相关信号通路尤其是肿瘤转移相关通路中扮演重要角色。研究表明，MMP-9 高表达与肿瘤细胞的放化疗抵抗密切相关[19-21]。有鉴于此，下调MMP-9 在HPV 阴性喉鳞状细胞癌的表达，有望显著抑制肿瘤细胞的侵袭转移能力，上调肿瘤细胞对放化疗的敏感性。另一方面，MMP-9 抑制剂，包括巴马司他、马力马司他、MMI270/CGS-27023A、GM6001、GI129471、CGS-25966、普马司他、利巴马斯他、盐酸强力霉素、米诺环素及阿奇霉素已应用于恶性肿瘤的治疗中[22，23]，目前已处于Ⅱ期临床试验。上述MMP-9 抑制剂也有望应用于HPV 阴性喉鳞状细胞癌的治疗中。

本研究报道了HPV 阴性喉鳞状细胞癌中MMP-9 的表达特点，但仍有一定的局限性：本研究共计收集109 例病例，标本量充足。但有肿瘤颈淋巴结转移的病例为28 例，样本量较少，对研究结果的精确性可能存在影响。未来仍需进行更大规模的有肿瘤颈淋巴结转移的HPV 阴性喉鳞状细胞癌的MMP-9 表达量的检测。

综上所述，通过调控MMP-9 相关肿瘤转移通路，有望提高HPV 阴性喉鳞状细胞癌放化疗治疗的疗效，极有可能改善喉癌患者的预后。未来将开展进一步研究，探明MMP-9 在HPV 阴性喉鳞状细胞癌发生发展过程中的具体作用机制，为喉癌的精准诊治、新型治疗提供理论基础及新的方向。