棘孢木霉SFC-3菌剂对小麦生理生化特性及小麦孢囊线虫的影响

王继雯 李磊 刘莹莹 甄静 岳丹丹 李冠杰 慕琦 杨金星 陈国参

摘要 采用盆栽試验探讨了不同剂量棘孢木霉SFC-3菌剂对小麦生理生化指标及生防效果的影响。结果表明：施用SFC-3菌剂对小麦的株高和主根长度没有明显影响（P>0.05），但可提高小麦的出芽率，当施菌剂量为1.0～2.0 g/kg时小麦的出芽率显著高于对照（P<0.05）;施用SFC-3菌剂小麦叶片中叶绿素含量和可溶性蛋白含量与对照相比均显著增加（P<0.05），其中施菌剂量为1.0 g/kg时最高。而小麦叶片中的MDA含量在施菌剂量为1.0 g/kg时显著低于对照和其他施菌处理（P<0.05）;当施菌剂量为0.5～1.0 g/kg时，小麦叶片中SOD和POD活性显著高于对照，进一步增加施菌剂量，小麦叶片中SOD和POD活性均随之显著降低（P<0.05）。当施菌剂量为1.5 g/kg和2.0 g/kg时每克根中小麦孢囊线虫2龄幼虫数量最少，发病级别最低，其相对防效分别为88.68%和87.04%，其次为施菌剂量1.0 g/kg的处理，其相对防效为80.50%。施用不同剂量的棘孢木霉SFC-3菌剂对小麦生理生化指标均有不同程度的影响，并且当施菌剂量为1.0 g/kg时对小麦生长和孢囊线虫的防治效果最好。

关键词 棘孢木霉; 小麦; 生理生化特性; 孢囊线虫; 生防效果

中图分类号： S 512.1

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020324

Effects of Trichoderma asperellum  SFC-3 agent on wheat physiological and biochemical characteristics and wheat cyst nematode

WANG Jiwen1，2， LI Lei1，2， LIU Yingying1， ZHEN Jing1，2， YUE Dandan1，2，LI Guanjie1，2， MU Qi1*， YANG Jinxing1， CHEN  Guocan1，2*

（1. Institute of Biology Co.Ltd.， Henan Academy of Sciences， Zhengzhou 450008， China;

2. Key Laboratory of Microbial Engineering of Henan Province， Zhengzhou 450008， China）

Abstract

Pot experiments were conducted to explore the effect of different dosages of Trichoderma asperellum SFC-3 on wheat physiological and biochemical indicators and biocontrol effects. The results show that the application of SFC-3 showed no effect on the plant height and main root length of wheat （P>0.05）， but increased the germination rate. The treatment with 1.0-2.0 g/kg of SFC-3 showed significantly higher germination rates than the control （P<0.05）. The content of chlorophyll and soluble protein in wheat leaves increased significantly in all treatments compared with that of the control （P<0.05）. When treated with 1.0 g/kg of SFC-3， the wheat showed the highest content of chlorophyll and soluble protein but the lowest MDA content in the leaves （P<005）. When treated with 0.5-1.0 g/kg of SFC-3， the SOD and POD activities in wheat leaves were higher than those of the control， but decreased significantly with the increase of the dose （P<0.05）. Compared with other treatments， the number of second-instar larvae of wheat cyst nematode per gram of roots and the disease index was the lowest at the dosage of 1.5 g/kg and 2.0 g/kg， with the relative control efficacy of 88.68% and 87.04%， respectively， followed by the treatment of 1.0 g/kg with the relative control efficacy of 80.50%. These results indicate that the application of different doses of T.asperellum SFC-3 has different effects on the physiological and biochemical indexes of wheat， and the control effect on wheat growth and cyst nematodes is best at the dosage of 10 g/kg.

Key words

Trichoderma asperellum; wheat; physiological and biochemical characteristics; cyst nematode; biocontrol efficacy

小麦作为我国主要的粮食作物之一，当前主要通过各种生物学方法来改善其生理生化指标从而提高产量[1]。但是长期以来，植物病虫害一直是制约小麦生产的严重问题之一。我国为提高小麦等农作物的单位面积产量，过度依赖化肥和农药，不仅造成了土壤肥力下降，而且对生态环境造成了严重的破坏，成为制约我国农业环保、可持续发展的瓶颈。因此，研发高效的生防菌剂对于改良土壤结构，提高小麦产量，防治病虫害有重要意义。近年来，国内外开始着力研究节能环保、无污染、可持续的新型生物肥料。新型生物肥料主要有生物菌剂和生物有机肥[2]。研究证实，广泛存在于土壤中的木霉，不仅在防治植物病害中具有重要作用，而且也具有良好的促进植物生长的效果[3]。木霉对番茄[4]、豇豆[5]、小麦[6]、黄瓜[7]等植物上的病害均具有良好的防治效果。李世贵[8]在田间施用木霉菌剂，其对黄瓜枯萎病的防治效果为51.79%，大幅提高了黄瓜的抗病能力。姚彦坡[9]证明哈茨木霉能有效降低马铃薯和辣椒的死苗率和病情指数，对马铃薯晚疫病和辣椒疫病防治效果明显，并且能明显降低土壤中病菌的种群数量。Zhang等[10]发现，长枝木霉Trichoderma longibrachiatum 对小麦孢囊线虫Heterodera avenae的寄生作用很强，并且其分泌的几丁质酶能够降解孢囊。除了木霉，其他真菌对小麦孢囊线虫也有抑制作用。Kerry等[11]发现，厚垣轮枝菌Verticillium chalamydosporium能使病田中孢囊数量减少40%以上。Stein等[12]从土样中分离出的腐霉菌Pythium和镰刀菌Fusarium可以使大田中孢囊减退率达98%。

因此，真菌对于发展绿色可持续农业具有重要作用[13-14]。目前，关于棘孢木霉Trichoderma asperellum 作为生物肥料对小麦生理生化指标的影响以及对小麦孢囊线虫的防效研究鲜有报道。本试验拟通过探讨棘孢木霉菌剂对小麦的生理生化指标的影响及生防效果，确定棘孢木霉菌剂的最佳施用量，为提高小麦产量及小麦孢囊线虫的防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用小麦品种为‘郑麦9405，购于河南省农业科学院种子公司。试验土壤采于汝南县绿优家庭农场小麦孢囊线虫发生严重的地块。棘孢木霉SFC-3菌剂由河南省微生物工程重点实验室提供，该菌剂为粉状，其有效活菌数≥5亿/g，有机质≥20%，水分≤30%，塑料花盆（直径25 cm，高20 cm）购于郑州市陈寨花卉市场。

1.2 溶液的配制

10%三氯乙酸（TCA）溶液：10 g TCA溶于50 mL蒸馏水中，搅拌均匀定容至100 mL。20 mg/mL L-甲硫氨酸溶液：2 g L-甲硫氨酸加磷酸缓冲液（pH 70）溶解并定容至100 mL，摇匀。0.1 mg/mL核黄素溶液：100 mg核黄素溶于少量1 mol/L的NaOH，然后加蒸馏水溶解并定容至1 000 mL，摇匀。1 mg/mL 氮蓝四唑（NBT）溶液：100 mg NBT加磷酸缓冲液（pH 7.0）溶解并定容至100 mL，摇匀。

1.3 试验方法

小麦盆栽试验每盆装4 kg土壤，试验共设5个处理，每处理设4个重复。处理1：不施菌剂的空白对照;处理2：每盆施SFC-3菌剂2 g（相当于0.5 g/kg）;处理3：每盆施SFC-3菌剂4 g （相当于1.0 g/kg）;处理4：每盆施SFC-3菌劑6 g（相当于1.5 g/kg）;处理5：每盆施SFC-3菌剂8 g（相当于2.0 g/kg）。

施菌后按50粒/盆播种小麦，自然光照，室温培养20 d，试验结束后，将小麦整株从盆中移出，洗净晾干后4℃保存备用;同时从每盆中随机均匀地取一部分土样，保存备用。

1.4 测定指标

1.4.1 小麦生长指标测定

分别统计各处理小麦的发芽数量，计算发芽率。发芽率=（发芽种子数/供检测种子数）×100%;同时从每个处理样品中随机抽取10株小麦，分别测量和统计株高和主根长度。

1.4.2 小麦叶片生理指标测定

1.4.2.1 小麦叶片中叶绿素含量测定

分别取一定量的各处理新鲜小麦叶片，洗净，晾干，剪碎，去中脉，混匀后称0.1 g，充分研磨匀浆后加入5 mL 95%乙醇，继续研磨直到组织发白[15-16]。过滤，用95%乙醇冲洗多次，定容至25 mL容量瓶中，摇匀，分别在663 nm和645 nm处测定吸光度。分别计算叶绿素a，叶绿素b，叶绿素a+b的含量和叶绿素含量。Ca=12.7×OD663-2.69×OD645;Cb=22.9×OD645-4.86×OD663;C（a+b）=8.02×OD663+20.20×OD645;叶绿素含量=[C（a+b）×V]/（M×1 000）。上述公式中Ca、Cb、 C（a+b）分别代表叶绿素a、叶绿素b和叶绿素a+b的含量，V代表提取液体积（mL）;M代表样品鲜重（g）。

1.4.2.2 小麦叶片中POD和SOD活性及可溶性蛋白、MDA含量的测定

各处理小麦叶片中过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定分别采用愈创木酚法和氮蓝四唑（NBT）光化还原法;小麦叶片中可溶性蛋白含量和丙二醛（MDA）含量分别用考马斯亮蓝法和硫代巴比妥酸法检测[17-19]。

1.4.3 小麦根部孢囊线虫侵染情况统计

从每个处理样品中随机选取10 株小麦完整的根系，洗净、晾干后分别称其鲜重，然后用次氯酸钠-酸性品红染色，在显微镜下观察并统计根内2龄幼虫数量，并按下面的公式分别计算出每克鲜根重中2龄幼虫数量、病情指数和防效。同时分别按表1标准对各处理进行病情分级。

每克鲜根重2 龄幼虫数量（NP）=2 龄幼虫数/鲜根重;

病情指数=∑（各级病株数×相应病级数）/（调查总株数×最高病级值）×100;

防效=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100%。

1.5 统计分析

采用DPS 7.0进行数据统计及差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 棘孢木霉菌剂对小麦株高和主根长度及出芽率的影响

由表2可知，施用不同剂量的棘孢木霉菌剂对小麦的株高和主根长度没有明显影响（P>0.05），但对出芽率有一定的促进作用，施菌剂量为1.0 g/kg的处理出芽率最高，并且施菌剂量1.0～2.0 g/kg的各处理与不施菌的对照相比，小麦的出芽率显著增加（P<0.05）。

2.2 棘孢木霉菌剂对小麦叶片中叶绿素含量的影响

由图1可以看出，施用棘孢木霉菌剂的处理小麦叶片的叶绿素含量显著高于对照（不施用棘孢木霉菌剂组）（P<0.05），当施菌剂量在1.0 g/kg时，小麦叶片中叶绿素含量最高，极显著高于对照（P<0.01）;然而随着施菌剂量的增加，小麦叶片中叶绿素含量反而有所降低。

2.3 棘孢木霉菌剂对小麦叶片中丙二醛（MDA）含量的影响

由图2可以看出，当施菌剂量为1.0 g/kg时，小麦叶片中MDA含量显著低于对照和其余处理（P<0.05），此时抑制作用最为显著。当施菌剂量为0～1.0 g/kg时，随着施菌剂量增加小麦叶片中MDA含量也随之减少，当施菌剂量为1.0～2.0 g/kg时，随着施菌剂量增加小麦叶片中MDA含量也随之增高，其中施菌剂量为2.0 g/kg时小麦叶片中MDA含量与对照相比差异不显著（P>0.05）。结果表明，与对照相比施菌剂量在0.5～1.5 g/kg时能极显著降低小麦叶片中的MDA含量（P<0.01）。

2.4 棘孢木霉菌剂对小麦叶片中超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响

由图3可以看出，与对照相比，施用0.5 g/kg棘孢木霉菌剂对小麦叶片中SOD活性的促进作用最显著（P<0.05）。施用剂量为0.5 g/kg和1.0 g/kg时小麦叶片的SOD活性较高，且两者差异不显著（P>0.05）。当剂量大于1.0 g/kg时，随着施菌剂量增加小麦叶片的SOD活性反而极显著降低（P<0.01）。

图3 棘孢木霉菌剂对叶片中超氧化物歧化酶活性的影响

Fig.3 Effect of Trichoderma asperellum agent on

SOD activity in wheat leaves

2.5 棘孢木霉菌剂对小麦叶片中过氧化物酶（POD）活性的影响

由图4可以看出，施用0.5 g/kg棘孢木霉菌剂时小麦叶片中POD活性最高，极显著高于对照（P<0.01）;施用剂量为0.5 g/kg和1.0 g/kg的两个处理小麦叶片POD活性差异不显著（P>0.05），但进一步增加剂量，小麦叶片中POD活性显著减小（P<0.05），施菌剂量为2.0 g/kg的处理叶片POD活性极显著低于其余处理组（P<0.01）。

2.6 棘孢木霉菌剂对小麦叶片中可溶性蛋白含量的影响

由图5可以看出，与对照相比，施用棘孢木霉菌剂后小麦叶片中可溶性蛋白含量均极显著增加（P<0.01）。当施菌剂量为1.0 g/kg时，小麦叶片中可溶性蛋白含量最高;1.5 g/kg和2.0 g/kg處理可溶性蛋白含量差异不显著（P>0.05）。

2.7 棘孢木霉菌剂对小麦孢囊线虫的防治效果

从表3可知，与不施菌对照相比，随着施菌剂量增加，小麦每克根中2龄幼虫数量随之减少，其中，施菌剂量为1.5 g/kg时，每克根中2龄幼虫数量最少，病情指数最低，其防效最高，达88.68%，当施菌剂量大于等于1.0 g/kg时，其防效可达到80%以上，施菌剂量2.0 g/kg的防效为8704%，极显著高于05 g/kg和1.0 g/kg（P<001），与1.5 g/kg差异不显著（P>0.05）。

3 结论与讨论

宋玉娟[20]研究发现，棘孢木霉T-6的孢子悬浮液不仅能够增加烟草体内叶绿素和类胡萝卜素的含量，提高烟草的根系活力，促进烟草生长;还能够诱导烟草体内POD、SOD、CAT 3种防御酶的活性，有效地防治烟草根部病害黑胫病和根黑腐病，但是对烟草叶部病害赤星病的防治效果不明显。对比本试验，当土壤中施用1.0 g/kg棘孢木霉菌剂时，小麦叶片中的叶绿素含量最高;并且能极显著提高小麦叶片中SOD和POD酶活。这两种酶对于清除植物体内活性氧，减少植物在逆境中所受的伤害具有重要作用[21]。张春龙等[22]进行了淡紫拟青霉颗粒菌剂防治小麦禾谷孢囊线虫的田间试验，结果表明，100 kg/hm2颗粒菌剂处理的防效最好，在小麦苗期和小麦生长后期（抽穗至扬花期）的防效分别为5725%和40.22%。对比本试验：随着施菌剂量的增加，小麦每克根中2龄幼虫数量也随之减少，当施菌剂量大于或等于1.0 g/kg时，其防效达到80%以上，尤其是当施菌剂量为1.5 g/kg时，每克根中2龄幼虫数量最少，病情指数最低，防效最高，达8868%，生防效果明显优于张春龙的试验结果，这可能是因为本试验是盆栽试验而非大田试验，受外界环境影响较小，若要应用于生产还需进一步进行大田试验。棘孢木霉SFC-3对小麦孢囊线虫的防治主要依靠其生长过程中分泌的几丁质酶，这种酶可以有效降解孢囊，这与Zhang等[10]分离的长枝木霉的作用机理相同。

在小麦生长过程中叶绿素含量增高意味着植物的净光合速率、實际光化学效率增高，这有利于作物干物质的积累从而增加小麦的穗长和穗粒数[23];MDA是膜脂过氧化的产物，MDA的积累会损伤小麦膜系统，加速植物的衰老[24-25]，而SOD、POD等酶类则可以减少MDA的积累维持小麦中活性氧的平衡[26];可溶性蛋白和可溶性糖能够调节细胞渗透压，对小麦的生长、发育有重要作用[27-28]。本研究结果表明，施加棘孢木霉菌剂可以有效提高小麦叶片中叶绿素、可溶性蛋白含量、SOD和POD的活性，并能显著降低MDA含量，同时对小麦孢囊线虫病有较好的防效。该研究结果证明了棘孢木霉菌剂在防病促生方面有较高潜力，为提高小麦产量、开发新型生物肥料提供了理论依据。

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（责任编辑：杨明丽）