成都平原水旱轮作田常见根结线虫调查

徐幸 杨芳 王燕平 谢家廉 李跃建 彭云良 姬红丽

摘要 调查四川省成都平原地区水旱轮作田根结线虫发生情况及种类分布，为水旱轮作田根结线虫的防治提供依据。对成都平原15个县（市、区）28个乡（镇）共159块水旱轮作田的土样进行根结线虫普遍率调查，利用线虫ITS通用引物和8对根结线虫特异性引物对其中检出率高的地区重新采集的土样进行根结线虫种类分子鉴定。结果表明，成都平原水旱轮作田根结线虫平均检出率为40.25%。重新采集的土样共鉴定出5种根结线虫：拟禾谷根结线虫Meloidogyne graminicola、花生根结线虫M.arenaria、南方根结线虫M.incognita、北方根结线虫M.hapla和爪哇根结线虫M.javanica，各线虫的检出率分别为40.91%、34.09%、13.64%、13.64%和2.27%，其中2955%的样品由2种以上根结线虫混合侵染。拟禾谷根结线虫和花生根结线虫为该地区优势种群。

关键词 普遍率; 特异性引物PCR; 拟禾谷根结线虫; 花生根结线虫; 混合侵染

中图分类号： S 432.45

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020294

Prevailing species of root-knot nematodes from paddy-upland rotation fields in Chengdu plain

XU Xing1， YANG Fang1， WANG Yanping1， XIE Jialian1， LI Yuejian2， PENG Yunliang1， JI Hongli1*

（1. MARA Key Laboratory of Integrated Management of Pests on Crops in Southwest China， Institute of Plant Protection，

Sichuan Academy of Agricultural Sciences， Chengdu 610066， China; 2. Institute of Horticulture Research， Sichuan

Academy of Agricultural Sciences， Chengdu 610066， China）

Abstract

To investigate the prevailing species of root-knot nematodes （RKNs） from paddy-upland rotation fields in Chengdu plain of Sichuan province， 159 soil samples were taken from 28 townships in 15 counties （districts or cities）. The RKNs species were identified by universal primer pair for ITS region of RKNs and eight species of species-specific primers amplification from re-collected samples where high infestation incidence was found in the first round of sampling and bioassay. 40.25% of 159 samples were found to be able to cause root knots in the root systems of either rice or tomato. Five species of RKNs， i.e.， Meloidogyne graminicola， M.arenaria， M.incognita， M.hapla and M.javanica were identified， with the infestation incidence of 40.91%， 34.09%， 1364%， 13.64% and 2.27%， respectively. 2955% of the re-investigation samples were infested with two or more species of RKNs. M.graminicola and Marenaria were the dominant species in paddy-upland rotation fields in Chengdu plain.

Key words

infestation incidence; species-specific PCR; Meloidogyne graminicola; M.arenaria; mixed infestation

根結线虫Meloidogyne spp.作为全球农业经济危害最严重的植物病原线虫，其寄主和地理分布范围广泛[1]。根结线虫侵染植物根部后，根部细胞过度分裂、膨大，使根部形成根结，导致根系的吸收能力降低，被害株长势衰弱、甚至提早死亡。此外根结线虫侵染造成植物根系的损伤还利于土壤中植物寄生真菌的侵入和危害。目前世界上报道有98种根结线虫，其中有40余种在我国已有发生记载[2]。随着种植结构调整，根结线虫病在我国发生和危害日益加重，一般导致作物减产15%～25%，部分田块损失高达70%以上，甚至绝收[2]。在根结线虫研究中，国内外文献报道中最常见、危害最重的有南方根结线虫M.incognita、花生根结线虫M.arenaria、爪哇根结线虫M.javanica、北方根结线虫M.hapla[2]，以及近年来新发生并严重威胁水稻等作物生产的拟禾谷根结线虫M.graminicola[3]。拟禾谷根结线虫广泛分布于热带和亚热带地区，在水稻、旱稻、直播稻、秧田和育秧工厂内均可危害，受害水稻产量损失率最高可达 80%以上[1]。该线虫于2000年在我国海南三亚首次发现以来已陆续在福建、湖北、湖南、浙江等地有发生报道[4-6]，本实验室也在四川水稻种植区发现其危害[7]。已有研究表明，多种根结线虫混合发生在我国南方是常见现象[8-9]。

水旱轮作是我国南方最主要的耕作形式之一，仅西南地区常年实行水旱轮作的稻田即超过250万hm2[10]，成都平原水旱轮作历史悠久，是西南地区最重要的粮食和经济作物产区。长期以来，水旱轮作被认为是控制根结线虫病危害的有效手段[11-12]，但近年来屡有根结线虫在稻田发生和危害的报道，因此有必要对成都平原水旱轮作田根结线虫发生普遍率以及发生种类进行调查，为整个生态系统的健康管理提供依据。本研究对该区域水旱轮作田分布区的土壤进行了抽样，调查了根结线虫发生普遍率。采用通用引物和8种常见根结线虫的特异性引物扩增的方法鉴定了根结线虫混合种群。明确了成都平原水旱轮作田根结线虫发生普遍程度和种类分布，以期进一步明确其传播、发生规律，制定科学合理的防控策略。

1 材料与方法

1.1 样本采集

2017年12月-2018年2月在成都平原选择15个区（县、市）28个乡（镇）共159块田（表1）采集土样。自田一边起沿“Z”字形路线取样10点至田对边，各点取样深度约10～15 cm，每块田土样总重量在750～1 000 g之间，于室外遮阴保存备用。

1.2 样品生物测定

将采集的各田块土样擂碎，加入营养土和灭菌河沙（3∶1）后充分混匀，平均分成3份放入带托盘（15 cm×15 cm）的花盆（14 cm×14 cm）中，每盆土壤表面一半播种20粒左右番茄（‘美国红冠，四川省良明农业科技有限公司）种子，另半边播种20粒左右水稻（‘日本晴）种子，种子上面覆盖一层灭菌细土后，用有效成分75%百菌清600倍稀释液喷雾至表土充分湿润预防立枯病。28℃温室中培养50 d后，拔取水稻和番茄根系洗去泥沙后，调查两种植物根系有无根结形成，产生根结土样记为阳性+，无根结记为阴性-。检出根结土样数占总土样数的百分比即为该地区根结线虫普遍率。

1.3 根结线虫种类重检测与鉴定

2018年8月和2019年3月分别在上述测定中土样根结线虫检出率较高的什邡、广汉和绵阳市安州区按照上述1.1方法重新采集44块田土样（表2），按1.2方法进行根结线虫发生普遍率重复测定。

1.3.1 土样线虫DNA提取

收集重复测定中检出根结土样的水稻和番茄根系后，清洗掉泥沙，用剪刀剪碎根系并剪破根结以浅盘分离法分离获得2龄幼虫悬浮液。线虫悬浮液于4℃冰箱静置过夜后，收集根结线虫于2 mL离心管中，再将离心管液氮速冻30 s后放在振动磨样机中磨样30 s，参照崔汝强等的方法[13]提取线虫DNA。

1.3.2 根结线虫种类分子鉴定

根据已发表文献中线虫DNA通用引物和特异性扩增引物进行PCR扩增[14-18]（引物序列见表3）。采用25 μL反应体系： 2×Master MIX（北京擎科生物） 12.5 μL， 10 μmol/L

上、下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O补足至25 μL。PCR擴增条件：94℃ 3 min;94℃ 30 s，退火温度（表3）30 s，72℃ 50 s，35个循环;72℃ 5 min。其中不加模板DNA的灭菌ddH2O作为阴性对照，用收集的8种已知种类根结线虫DNA样品作为阳性对照。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶110 V电泳 20 min进行检测，在紫外照胶仪上观察并照相，剩余PCR产物送擎科生物公司进行测序，测序结果在NCBI网站进行BLAST比对分析，并将序列上传至GenBank得到登录序列号。

2 结果与分析

2.1 成都平原根结线虫发生普遍率

采集的159块田土样（表1）中，有64块田土样在所播种的水稻或番茄根系产生根结，根结线虫发生普遍率平均为40.25%，其中25.16%的土样中种植的番茄感染根结线虫，17.61%的土样中种植的水稻感染根结线虫，8.81%的土样中两种作物均感染根结线虫。

根据调查结果，我们选取土样根结线虫检出率高的3个地区，即在什邡市采集22块田、广汉市10块田和绵阳市安州区12块田，共重新采集44块田土样并进行土样根结线虫检测，其中共26块田土样能使水稻或番茄产生根结，根结线虫发生普遍率为59.09%，其中使番茄或水稻感染根结线虫的土样各占54.55%。使两种作物感染根结线虫的土样占50%（表2）。

2.2 病原线虫分子生物学鉴定

利用线虫ITS通用引物RK28SF/MR对重新采集的26个检出根结土样中分离出的线虫DNA样品进行PCR扩增，均能得到约612 bp的唯一扩增片段，与根结线虫DNA标准样品的PCR扩增片段大小一致。随后，用8种常见根结线虫的特异性引物对26个阳性土样的线虫DNA进行PCR扩增，共得到5种大小不同的片段，其大小分别与标准样品DNA的扩增产物长度一致（图1）。从5种扩增片段中每种选择1个进行双向测序，并进行BLAST比对。结果表明，样品YX8序列（登录号：MT406773）与已知拟禾谷根结线虫M.graminicola（登录号：MK559561.1）序列相似度99%以上，ZH1（登录号：MT406772）与已知南方根结线虫M.incognita（登录号：MK292132.1）序列相似性为100%，YX2（登录号：MT408129）与已知花生根结线虫M.arenaria（登录号：KP253748.1）序列相似度99%以上，XL3（登录号：MT408130）与已知爪哇根结线虫M.javanica（登录号：KF041313.1）序列相似度在91%以上，YX1（登录号：MT408131）与已知北方根结线虫M.hapla（登录号：GQ130137.1）序列相似度在99%以上。

44份新采集土样中，共有26份含根结土样，其中18份土样中检出拟禾谷根结线虫，在44份总样品中的发生率为40.91%，检出的其他几种线虫发生率分别为：花生根结线虫（34.09%）、南方根结线虫（13.64%）、北方根结线虫（13.64%）以及爪哇根结线虫（2.27%）。44份重测样品中未检出象耳豆根结线虫M.enterolobii、奇特伍德根结线虫M.chitwoodi和伪哥伦比亚根结线虫M.fallax（表4）。

44份样品中29.55%的样品仅检测出1种根结线虫，其中拟禾谷根结线虫占13.64%，花生根结线虫占11.36%，北方根结线虫和南方根结线虫各占227%;29.55%的样品由两种以上根结线虫混合侵染，其中2种、3种、4种和5种根结线虫混合侵染的土样占重测样品的比例分别为15.91%、11.36%、2.27%和0。混合侵染样品中最常见的为拟禾谷根结线虫和花生根结线虫两种根结线虫混合侵染，占重测样品的9.09%，拟禾谷根结线虫、花生根结线虫与南方根结线虫等3种根结线虫混合侵染，以及拟禾谷根结线虫、花生根结线虫与北方根结线等3种根结线虫混合侵染的土壤样品数均为2个，占重测样品的4.55%，新采集样品中有一份样品是由拟禾谷根结线虫、花生根结线虫、南方根结线虫和北方根结线虫等4种线虫混合侵染，占2.27%。

3 结论与讨论

成都平原是西南地区粮食和蔬菜等作物最重要的产区，也是全国重要农区[10]。水旱轮作是成都平原最主要的耕作方式，但关于水旱轮作田根结线虫发生情况报道较少[7， 19-20]。本次调查发现成都平原水旱轮作田已经是根结线虫重发区，土样根结线虫普遍率达40.25%，而在根结线虫普遍率高的区县，根结线虫土样普遍率高达59.09%，50%的土样属于2种及以上根结线虫混合侵染，为根结线虫的防控增加了难点。以往研究结果表明，水灌溉和非寄主作物轮作是防控根结线虫病害的有效手段[11]。一般认为，水旱轮作中水稻生长期淹水时间长能满足防治线虫的淹水条件[11];而在冬季间种芥末和小油菜，然后再间种水稻和芝麻，土壤中拟禾谷根结线虫幼虫数能降低65%[21];烤烟与菽麻Crotalaria juncea间作对根结线虫病防效为64.23%[22];高丹草Sorghum bicolor × sudanense与感病蔬菜轮作亦能明显减少根结线虫种群数量[23]。然而，此次调查发现侵染水稻的拟禾谷根结线虫已成为成都平原的优势种，拟禾谷根结线虫与其他根结线虫的混合发生降低了水旱轮作和不同作物轮作、套作和间作的根结线虫的防治效果，并将使成都平原水旱轮作田根结线虫的发生和危害进一步加重。

利用根结线虫特异性引物PCR扩增鉴定出这些地区共5种根结线虫，包括发生率高的拟禾谷根结线虫和花生根结线虫，其次南方根结线虫，北方根结线虫常有发生，爪哇根结线虫零星发生。刘国坤等[24]发现水稻田周边杂草油芒Eccoilopus sp.是水稻根结线虫的寄主，来自油芒的根结线虫能严重侵染水稻，油芒根部根结卵囊孵化产生的2龄幼虫通过灌溉水进入水稻田，成为水稻根结线虫病的重要侵染源，导致该区域水稻严重侵染。本次调查发现田埂，稻田周边旱地、绿化带以及水渠破损处都生长有大量杂草，多为根结线虫适宜的寄主，导致根结线虫可能通过雨水、灌溉水从稻田周边环境中侵入稻田。水渠灌溉水、稻田之间自流灌溉以及成都平原稻田的跨区域机械化耕作，同样也将导致根结线虫的長距离传播使得该区域根结线虫分布更加广泛和严重。

本次研究发现成都平原地区水旱轮作田根结线虫分布广泛、种类多样，多数田块不同种类混合发生，迫切需要进一步深入研究，寻找可利用的非寄主作物轮作减少根结线虫基数，阻断各种侵染来源，筛选有效的轮作植物、防治药剂，并且协助育种家加速抗根结线虫品种的选育，为制定科学合理的综合防控措施提供依据。

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（责任编辑：田 喆）