以大黄制剂为例的一测多评法应用研究

潘海娟，林 玲，谢学建，高 茗

0 引 言

一测多评(quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS)，是通过测定一个成分(对照品容易得到者)实现多成分(对照品难以得到或不稳定者)同步定量的质量评价模式[1-2]。该方法2006年提出，至今已有近 15 年时间，经过众多研究者的共同努力，QAMS已然成为了适合中药特点的质量评价新模式[3-5]。同时其应用范围已不再局限于中药饮片、成方制剂等的质量评价，在炮制工艺优化、制剂过程考察和一致性评价等方面也有应用研究[6-7]。我院药剂科依托医院全军肾脏病研究中心，多品种、多剂型的大黄制剂是科室的一大特色。保肾片、新保肾片、炎黄保肾胶囊、新肾炎胶囊是我科产值较高的4个大黄制剂，主要成分均为大黄提取物。本研究通过探讨含大黄的成方制剂新保肾片中相同待测成分的定量分析，建立内参物与待测成分之间的相对校正因子(f) 并将结果应用于组成成分相似制剂(保肾片、炎黄保肾胶囊、新肾炎胶囊)的质量评价，对于拓展 QAMS 在科研和生产实践中减少重复劳动等的应用具有重要意义。

1 仪器与材料

1.1 仪器Agilent1100高效液相色谱仪，DAD二极管阵列检测器；电子分析天平(FA1204B，上海精密科学有限公司)；美国Waters e2695高效液相色谱系统，包括在线脱气机，自动进样器Prominence SIL-20A，二极管阵列检测器waters2998和柱温箱CTO-20A，Empower色谱工作站；万分之一电子天平(FA1204B，上海精密科学仪器有限公司)；百万分之一电子天平;超声波清洗机(AS20500A，Auto Science)。Kromasil 100-5 C18色谱柱：(4.6×250 mm；5 μm)；Agilent TC-18；Accurasil C18；Diamonsil C18；Luna 5μ ODS-2 C18。

1.2 材料芦荟大黄素(批号110795-201007)、大黄素甲醚(批号110758-201013)、大黄酚(批号110796-201319)、大黄素(批号110795-201007)、大黄酸(批号110757-200206)，以上对照品均购自中国药品生物制品检定所，供含量测定用。上述对照品经面积归一化法测定，纯度均〉98%。甲醇(江苏汉邦科技有限公司)、乙腈(美国Tedia试剂公司)为色谱醇，水为超纯水，95 %医用乙醇、磷酸等均为国产分析纯。新保肾片样品批号分别为YP1-0225、YP2-0311、YP3-0326、YP4-0523、YP5-0529、YP6-0606、YP7-0611、YP8-0626、YP9-0724、YP10-0811；保肾片YP1-0302、YP2-0320、YP3-0409、YP4-0427、YP5-0521、YP6-0826、YP7-0920、YP8-1015、YP9-1122、YP10-0126；炎黄保肾胶囊YP1-0408、YP2-0505、YP3-0714、YP4-0906、YP5-1012、YP6-1117、YP7-1215；均由东部战区总医院药剂科提供。

2 结 果

2.1 色谱条件Kromasil 100-5 C18色谱柱，流动相为甲醇(A)-0.1 %磷酸水溶液(B)，等度洗脱(0～80 min，A∶B=70∶30)，体积流量1.0 mL/min，柱温35 ℃，检测波长254 nm，进样量10 μL。

2.2 对照品溶液的制备精密称取各对照品，加甲醇溶解制成芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品浓度分别为24.46、33.80、33.60、65.64和106.28 μg/mL的混合对照品溶液1#备用。再分别精密吸取上述混合对照品溶液9.0、8.0、7.0、6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液2#～10#，备用。

2.3 供试品溶液的制备取重量差异项下的新保肾片20片，除去薄膜衣，精密称定，研细，过四号筛，精密称取细粉约0.3 g，置平底烧瓶中，加甲醇50 mL，称定重量，加热回流2 h，放冷，用甲醇补足减失重量，摇匀，14 000 r/min 离心5 min，取上清液备用。 供试品与混合对照品HPLC图谱见图1。

1：芦 荟大黄素；2：大黄酸；3：大黄素；4：大黄酚；5：大黄素甲醚a:供试品;b:混合对照品图1 供试品与混合对照品色谱图

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察分别精密吸取“2.2”项下10个浓度的混合对照品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，测定芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的峰面积，得到各成分的回归方程及线性范围。见表1。

表1 5种大黄游离蒽醌的回归方程和线性范围

2.4.2 精密度实验精密吸取同一份对照品(编号：6#)溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，连续进样5次，分别测定芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的峰面积，相对标准偏差(RSD)分别为1.11%、0.95%、1.03%、1.29%和1.88%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 重复性实验取同一批新保肾片(样品编号：YP2-0311)按“2.3”项下方法平行制备5份，在“2.1”项下色谱条件测定芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的峰面积，并计算得到各成分含量RSD分别为0.91%、2.277%、2.03%、1.16%、0.94%，表明该方法的重复性良好。

2.4.4 稳定性实验取同份新保肾片(样品编号：YP2-0311)，室温放置，分别在0、2、4、6、10、12 h时取样按“2.1”项下色谱条件测定芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的峰面积，并计算各成分峰面积，RSD分别为2.64%、2.57%、2.95%、2.78%和2.62%，表明溶液在12 h内稳定性良好。

2.4.5 加样回收实验取同一批新保肾片(样品编号：YP2-0311)按“2.3”项下方法平行制备5份，在“2.1”项下色谱条件测定芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的峰面积，并计算得到各成分含量RSD分别为0.91%、2.277%、2.03%、1.16 %、0.94%，表明该方法的重复性良好。

取己知含量的新保肾片制剂样品(样品编号：YP2-0311)，相当于芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚分别为0.335、0.798、0.456、1.407、1.007mg)的粉末0.3 g，精密称定9份分成3组，各组分别按样品含量分别加入80%、100%、120%的对照品，在“2.1”项下色谱条件测定5种成分的峰面积，并计算加样回收率和RSD。芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚加样回收率分别为102.39%、100.71%、102.31%、102.69%、100.89%，RSD分别为1.39%、2.06%、1.66%、0.94%、2.58%。

2.5 相对校正因子的确定校正因子的计算按线性关系考察项下的试验方法，f=fi/fs=(Ai/Wi)/(As/Ws) ，Ai 为待测成分的峰面积，Wi 为待测成分的质量；As为内参物 s 的峰面积，Ws 为内参物 s 的质量。取“2.2”项下混合对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下，进样体积为 1、2、5、8、10、12、14、16、18、20 μL ，计算以大黄素为内参物时，5种大黄游离蒽醌间的f值，分别为f芦荟大黄素/大黄素=0.75、f大黄酸/大黄素=0.87、f大黄酚/大黄素=0.89、f大黄素甲醚/大黄素=3.39。

2.6 相对校正因子的耐用性评价

2.6.1 不同色谱柱系统对f的影响采用Kromasil 100-5 C18色谱柱，分别考察了Agilent1100和Waters e2695共2种不同的高效液相色谱柱对相对校正因子的影响。结果显示芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚的相对校正因子的RSD分别为2.28%、1.03%、1.57%和4.29%。

2.6.2 不同柱温对f的影响釆用Agilent1100高效液相色谱仪，Kromasil 100-5 C18色谱柱，分别在30 ℃、35 ℃和40 ℃对芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚相对校正因子进行测定。结果显示相对校正因子的RSD分别为1.49%、1.53%、0.23%、3.19%，表明柱温对相对校正因子无显著性影响。

2.6.3 不同流速对f的影响釆用Agilent1100高效液相色谱仪，Kromasil 100-5 C18色谱柱，分别在不同流速(0.9 mL/min、1.0 mL/min、1.1 mL/min)下对芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚相对校正因子进行测定。结果显示相对校正因子RSD分别为0.74%、0.88%、0.88%、3.26%，表明流速对相对校正因子无显著性影响。

2.6.4 不同修饰剂对f的影响釆用Agilent1100高效液相色谱仪，Kromasil 100-5 C18色谱柱，分别考察流动相中不容修饰剂对5种蒽醌间相对校正因子进行测定。结果显示相对校正因子无显著性影响，RSD<5%。综合不同系统、不同色谱柱、不同柱温、不同流速度、不同修饰剂对相对校正因子的影响，最终取所有相对校正因子的平均值为f芦荟大黄素/大黄素=0.75、f大黄酸/大黄素=0.88、f大黄酚/大黄素=0.89、f大黄素甲醚/大黄素=3.25。

2.7 待测成分的色谱峰定位待测成分色谱峰的定位通常采用相对保留值法或保留时间差法辅以待测成分的紫外吸收特征，一般即能对色谱峰进行准确定位。相对保留值即待测成分i与内参物s间的保留时间的比值，计算公式：ri/s=tRi/tRs；保留时间差即待测成分i与内参物s间保留时间的差值，计算公式：△tRi/s=tRi-tRs；实验中分别考察了复方蒽醌类成分间的相对保留值和保留时间差在不同品牌仪器和不同品牌色谱柱中的重现性。结果表明，保留时间差的波动较为明显，相对保留值的波动较小，因此采用相对保留值法进行新保肾片复方中蒽醌类待测成分色谱峰的定位较为可行。最终确定5种复方制剂蒽醌间的相对保留值分别为r芦荟大黄素/大黄素=0.36、r大黄酸/大黄素=0.52、r大黄酚/大黄素=1.36、r大黄素甲醚/大黄素=2.13。

2.8 QAMS和外标测定结果比较首先采用外标法(ESM)对10批新保肾片(批号分别为YP1-0225、YP2-0311、YP3-0326、YP4-0523、YP5-0529、YP6-0606、YP7-0611、YP8-0626、YP9-0724、YP10-0811)样品中的5种蒽醌类成分进行多成分同步测定，再用建立的QAMS法对待测成分进行定位并计算含量，最后将2种方法得到的结果以相对误差进行评价，以验证QAMS技术用于新保肾片中蒽醌类多成分质量评价的准确性。结果表明，2种方法所得结果无显著性差异，相对误差<5%，表明建立的新保肾片QAMS质量评价模式具有较好的准确性与可行性。见表2。

表2 QAMS和ESM测得新保肾片中5种蒽醌类成分的含量结果(n=2，mg/g)

2.9 QAMS数据在类似制剂中的应用将本实验结果f芦荟大黄素/大黄素=0.75、f大黄酸/大黄素=0.88、f大黄酚/大黄素=0.89、f大黄素甲醚/大黄素=3.25应用到我科保肾片、炎黄保肾胶囊、新肾炎胶囊的含量测定中，比较在不同制剂、不同剂型中ESM和QAMS的测定结果，结果表明，一测多评质量评价体系应用于我院的保肾片、炎黄保肾胶囊、新肾炎胶囊时方法所得结果无显著性差异，相对误差<5 %，表明在主要组成均为大黄提取物的制剂中，即便是不同的剂型，所建立的QAMS质量评价模式也可以用于不同制剂的质量控制。见表3-表5。

表3 QAMS和ESM测得保肾片中5种蒽醌类成分的定位结果 (n=2，mg/g)

表4 QAMS和ESM测得炎黄保肾胶囊中5种蒽醌类成分的定位结果(n=2，mg/g)

表5 QAMS和ESM测得炎黄保肾胶囊中5种蒽醌类成分的定位结果(n=2，mg/g)

3 讨 论

QAMS经过多年的发展与实践，在中药材，饮片和提取物质量评价中的应用已被行业普遍接受，但应用于中成药仍处于探索和研究阶段。建立了QAMS检测方法在实际生产检测中操作较EMS方法更加简便、快速[8-10]。本研究选择了主要组成相似，但剂型不同的四个制剂，以新保肾片为主要研究对象，建立的QAMS评价模式应用于保肾片、炎黄保肾胶囊、新肾炎胶囊，结果表明ESM与QAMS数据无显著性差异。实验在相同色谱条件下待测成分分离度良好并且无干扰情况下，经过系统验证的药材中目标成分的fs 可以直接应用于制剂对应成分含量计算，无需重新进行fs 的建立和耐用性考察，可以节省大量的研究时间和分析成本[11-12]。研究为大黄制剂质量标准的完善和提高提供数据支撑的同时，并为拓展一测多评法在中成药质量评价和控制中的应用，为组成类似的系列制剂质量标准的建立提供了新的研究思路和方法参考[13-15]。