提高前列腺癌细胞转染效率的氟化PEI 基因载体研究

郭世英

（东北林业大学生命科学学院 东北盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040）

聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine, PEI）是一类阳离子聚合物，能够帮助目的基因实现内体逃逸，提高转染效率。然而，PEI 也具有较大的细胞毒性。研究表明PEI 通过修饰后可提高其基因转染效果并降低对转染细胞的毒性[1]。

氟元素电负性大，氟修饰的化合物常具有疏水疏油的性质[2]，本研究使用五氟丙酸酐对PEI 进行修饰，以提高其与细胞膜的亲和力，增加转染效率。同时，氟修饰可降低PEI 的细胞毒性，改善细胞摄取、内体逃逸和细胞内DNA 释放过程。此外，由于氟化聚合物低表面能，在低浓度时倾向于相互结合，因此氟修饰后的PEI（PEIF）在较低氮磷比时便能与核酸形成复合物。

1 实验部分

1.1 实验材料与仪器

PEI（MW:1.8kDa ），五氟丙酸酐，pCMV-GFP 质粒，PC3 细胞系，Brookhaven PALS/90P Zeta PALS 电位粒度分析仪、凝胶电泳装置，荧光显微镜。

1.2 实验方法

1.2.1 PEIF 的制备及表征

将1 mmol PEI 和3.6 mmol 三乙胺溶解于20mL 无水甲醇中，后缓慢滴加到含3 mmol 五氟丙酸酐的10 mL 无水甲醇中，室温下搅拌72 h 后旋转蒸发除去溶剂，用去离子水复溶后装入500 Da 的透析袋中透析48 h，之后冻干得到PEIF。用核磁共振氟谱对其结构进行表征。

1.2.2 PEI/pCMV-GFP、PEIF/pCMV-GFP 复合物的制备及表征

将5μg 质粒溶于1.8 mL 超纯水中，加入200μL 的PEI 溶液（1mg/mL），混匀后室温静置30min 得到PEIF/pCMV-GFP 复合体。室温下测定复合物的粒径和电位。PEIF/pCMV-GFP 复合物通过相同的方法制备。

1.2.3 凝胶阻滞实验

将1μg质粒与不同浓度PEIF 溶液混匀，室温孵育30min。以质粒DNA为对照，点样到1.0%的琼脂糖凝胶中，120V下电泳30min 后采集图像。

1.2.4 PEI、PEIF 转染PC3 细胞

PC3 细胞汇合度达到80%时吸去旧培养基，加入150μL 无血清培养基和50μL 的DNA/PEI复合物。DNA/PEI 复合物制备过程：将1μg 质粒加入无血清培养基中，再加入PEI，室温孵育30min 后，将DNA/PEI 复合物加入细胞孔板中，轻轻混匀。

2 结果与讨论

2.1 PEIF 的构建与表征结果

用五氟丙酸酐与1.8 kDa PEI 反应合成PEIF。PEI 与氟代丙酸酐的质量比为1:6、1:3、1:1.5，产物表示为PEIF（1:6）、PEIF（1:3）、PEIF（1:1.5）。图2 所示，通过PEI 与五氟丙酸酐的反应合成了含酰胺键的PEIF，酰胺键的出现表明PEIF 复合物的成功构建。

图1 PEIF 载体构建

图2 PEIF 的核磁共振氟谱图

2.2 pCMV-GFP/PEI、pCMV-GFP/PEIF 复合物构建及表征

的结果分析

对复合物粒径和电位进行表征，并得到了相应的结果（表1）。复合物在最佳质量比例下带正电荷，所有PEIF 都能将DNA浓缩成100nm 以内的纳米粒子。

表1 不同质量比的DNA/PEIF 粒径、电位、分散系数

2.3 凝胶阻滞实验的结果分析

利用凝胶电泳研究了PEIF 的DNA 浓缩能力。图3 所示，PEIF 具有较好的DNA 结合能力，在相对较低的质量比下有效阻碍DNA 迁移。结果显示，pCMV-GFP/PEI 的质量比为4:1 时完全阻滞；DNA/PEIF（1:6）质量比在1:2 时完全阻滞；DNA/PEIF（1:3）质量比在4:1 时完全阻滞；DNA/PEIF（1:1.5）质量比在8:1 时完全阻滞。

图3 凝胶阻滞结果

2.4 PEI、PEIF 的DNA 转染效率

利用GFP 为报告基因，在PC3 细胞中检测PEI 和PEIF 的DNA 转 染 效 果，Lipo 3000 为 对照。图4 为不同质量比PEIF 转染细胞后GFP 的表达情况。与Lipo3000 相比，PEI、PEIF 的细胞毒性显著低于Lipo3000。单纯PEI 表现出极低的GFP 转染效果，而PEIF 转染效果显著提高，说明氟修饰可显著增强PEI 转染效率。此外，PEIF 以较低的质量比率获得最佳的转染。PEIF（1:6）、PEIF（1:3）、PEIF（1:1.5）的转染效率依次增加；DNA/PEIF（1:6）质量比在1:8、1:10 开始有转染效果；质量比1:14、1:16、1:18、1:20 的DNA/PEIF（1:3）转染效率较高；质量比1:10、1:12、1:14、1:16、1:18、1:20 的DNA/PEIF（1:1.5）转染效率较高。在所有PEIF 中，PEIF（1:1.5）转染PC3 细胞的效率最高，这是由于PEI 表面接枝过量的氟链会降低树枝状分子的表面电荷密度，从而阻止稳定聚合物/DNA 复合物的形成。转染48h 的结果显示，PEIF（1:1.5）与质粒的质量比为1:20 时，其转染效率高于Lipo3000。

图4 PEI、PEIF 转染PC3 细胞48h

3 结论

PEI 经氟修饰后形成的PEIF 转染效率显著增加，氟修饰的PEIF 能够降低细胞毒性，保持较高的转染效率。本研究设计了不同的氟修饰比例以及质粒DNA 与氟化PEI 的质量比，通过凝胶阻滞和转染实验探究最适转染效率对应的比例，筛选获得比转染试剂Lipo3000 毒性更低且转染效率更高的PEIF，研究发现，质量比为1：20 的氟化PEI（1:1.5）可实现质粒载体在PC-3 细胞中的高效表达，这为改良高效的质粒递送转染试剂提供了新思路。