调节性B细胞在接受脱敏治疗过敏性哮喘患儿中的变化及意义

马卓娅，郑跃杰，王国兵，王承倩

过敏原特异性免疫治疗(allergen-specific Immunotherapy，AIT)是目前世界变态反应组织(World Allergy Organization,WAO)推荐的唯一可以针对过敏病因的治疗方法，主要有舌下免疫治疗(sublingual immunotherapy，SLIT)和皮下注射免疫治疗(subcutaneous immunotherapy，SCIT)给药途径。SCIT是给患者重复皮下注射剂量不断增加的过敏原，逐渐增加至较高剂量，使患者对这一过敏原耐受，最终达到改善症状。尽管对该治疗有丰富的使用经验，但其临床改善的机制仍不是很清楚。目前多认为，多种细胞及相关因子在治疗过程中参与了过敏原特异性免疫耐受的建立[1]。Breg是具有负向免疫调节作用B淋巴细胞，其免疫调节作用主要通过产生IL-10、TGF-β、IL-35等细胞因子、细胞间接触机制等实现[2]。并且在哮喘等过敏性疾病中发挥作用。基于此，本研究对接受螨虫SCIT治疗的过敏性哮喘患儿外周血Breg细胞及相关细胞因子进行了检测，分析其在SCIT过程中可能发挥的作用。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2018年5月至2019年8月深圳儿童医院呼吸专科就诊的20例螨虫过敏哮喘患儿，给予SCIT。SCIT治疗药物为螨变应原注射液(阿罗格，默克雪兰诺公司，德国)和屋尘螨变应原制剂(安脱达，ALK-Abello公司，丹麦)。男15 例,女 5 例,年龄5～13岁[(8. 8±2. 3)岁]。过敏性哮喘诊断标准参照中华医学会儿科学分会呼吸学组制订的诊断标准及2018年全球哮喘防治创议(Global Initiative for Asthma,GINA)[3-4]；外周血过敏原d1户尘螨和/或 d2粉尘螨特异性IgE(special IgE, sIgE)阳性且≥2级(sIgE≥0.70 kIU/L);所有受试者监护人和或受试者均表示对实验方案知情并签署知情同意书，深圳市儿童医院学术伦理委员会已通过该实验方案。

1.2 螨虫过敏原特异性IgE检测

所有患儿均采用UniCAP1000全自动过敏原定量检测系统(法玛西亚，瑞典)，采用酶联免疫荧光法检测外周血d1户尘螨、d2粉尘螨sIgE；部分患儿检测mx2霉菌组(青霉、牙枝霉、薰曲霉、假丝霉、链格孢霉、盐球菌霉)、ex1动物皮毛组(猫狗上皮及皮屑、牛皮屑、马皮屑)、i6蟑螂等IgE。

1.3 采集外周血及样品初处理

所有入组患者在SCIT治疗开始前和SCIT剂量递增阶段(4～6个月)完成后分别采集外周血 3 mL，肝素抗凝，迅速送检。 取2 ml肝素抗凝的外周血，500g离心5 min分离血浆备用。

1.4 分离CD4+T、CD19+B淋巴细胞

取无菌抗凝静脉血0.5 mL，聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(P=1.077)密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)。分别采用单克隆抗体CD4抗体、CD19抗体包被的磁珠(美国LifeTec公司, 113.31D和111.43D)分离CD4+T、CD19+B淋巴细胞。

1.5 流式细胞术分析Breg和Treg、Th1，Th2和Th17

使用全血直接计数方法，用CD19-eFluro450(eBioscience，美国)标记Breg，以CD24-FITC、CD27-APC、CD80-PE、CD86-PE、CD1d-PE-Cyanine7 (eBioscience，美国)染色30 min。检测并分析CD19+CD24highCD27+Breg的比例以及CD80、CD86、CD1d的平均荧光强度。另取部分全血，用CD4-eFluor450封闭，固定并破膜1 h，并用CD25-APC、Foxp3-PE (eBioscience，美国)染色30 min，检测CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例。取部分步骤1.4中分离的PBMC，接种于RPMI 1640细胞培养液(Corning，美国)，加入PMA、离子霉素、莫能菌素(SigmaAldrich，美国)，至终浓度分别为300 ng/mL，1μg/mL，2 μmol/ L。于37 ℃，CO2浓度为5%的细胞培养箱中培养6 h。经固定、破膜、封闭，并用CD4-eFluor450，IL-4 PE，IFN-γ APC和IL-17A PE-Cyanine7 (eBioscience，美国)染色30 min。流式细胞仪BD FACS CantoII(Becton，Dickinson and Company，美国)分析上述样品中 CD4+Th1、Th2和Th17细胞的比例。所有数据均通过流式细胞仪BD FACS CantoII分析软件DivaVer6.1.3获得，并转移至Flowjo V10软件进行分析。分析时先用CD19-eFluro450设门，检测并分析CD19+CD24highCD27+Breg的比例以及表面CD80、CD86、CD1d的平均荧光强度。另用CD4-eFluor450设门，检测CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例。最后用CD4-eFluor450设门，分析CD4+Th1，Th2和Th17细胞的比例。

1.6 实时定量RT-PCR测定Breg及T淋巴细胞相关细胞因子

分离总RNA:取步骤1.4已分离外周血CD4+T、CD19+B淋巴细胞，按试剂盒说明书(美国Ambion公司，AM1912)步骤分离总RNA，紫外分光光度计测定RNA含量及纯度。

RT-PCR: 总RNA为模板通过RT-PCR，测定IL-10、TGF-β、IFNG、T-bet、IL-4、GATA3、IL-17A、RORγt、Foxp3 核酸含量。引物序列及详细步骤参考本课题组前期实验[5]。

相对定量分析：使用LightCycler 480II real-time PCR仪(罗氏，瑞士)检测，并应用 LCS 1.5 软件分析，进行相对定量分析。

1.7 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-10和TGF-β

取步骤1.3分离的备用血浆, ELISA方法检测外周血浆中IL-10和TGF-β浓度。具体操作参照试剂盒说明书(eBioscience，美国,IL-10,BMS215 INST，TGF-β,BMS249-4)。IL-10检测敏感度为0.66 pg/mL, TGF-β检测敏感度为8.60 pg/mL。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 入组患者过敏原检测结果

20例患儿d1户尘螨、d2粉尘螨sIgE均为阳性且≥2级(sIgE≥0.70 kIU/L)，部分患儿根据病史等情况，检测其他过敏原(表1)。

表1 AIT治疗哮喘患儿过敏原检测结果Table 1 Results of allergen in patients with allergicasthma underging AIT

2:2 SCIT剂量递增阶段前后Breg 及 CD80、CD86、CD1d变化

在SCIT剂量递增阶段结束后，患儿外周血CD19+CD24highCD27+Breg占CD19+B细胞比例较治疗前明显增加(P<0.05)；CD80、CD86、CD1d与治疗前比较无显著改变(P>0.05)(表2，图1A)。

表2 SCIT剂量递增阶段前后Breg及CD80、CD86、CD1d表达Table 2 Changes of proportion of Breg and the expression of CD80, CD86, and CD1d before and after build-up

2.3 SCIT剂量递增阶段前后Th1、Th2、Th17和Treg变化

SCIT剂量递增阶段结束后，患儿外周血中Th1、Th2、Th17和Treg细胞比例较SCIT治疗前无明显变化(P>0.05)(表3，图1B、C)。

图1 流式细胞术检测1例患儿Breg、CD80、CD86、CD1d、Th1、Th2、Th17和Treg的变化

表3 SCIT剂量递增阶段前后Th1、Th2、Th17及Treg变化Table 3 Changes of proportion of Th1, Th2, and Th17 before and after build-up phase of %)

2.4 SCIT剂量递增阶段前后CD4+T、Breg细胞相关细胞分子mRNA水平变化

SCIT剂量递增阶段结束后，患儿外周血转录因子T-bet、GATA3、RORγt mRNA较SCIT治疗前明显下降，IL-10 mRNA则显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，IL-4、IL-17A和Foxp3 mRNA变化无统计学意义(P>0.05)。TGF-β mRNA虽有升高趋势，但变化无统计学意义(P>0.05)(图2)。

图2 SCIT剂量递增阶段前后CD4+T、Breg淋巴细胞相关细胞因子mRNA表达

2.5 SCIT剂量递增阶段前后外周血IL-10和TGF-β蛋白水平变化

SCIT剂量递增阶段结束后，患儿外周血浆IL-10和TGF-β蛋白水平均较SCIT治疗前明显增高(P<0.05)(图3)。

图3 SCIT剂量递增阶段前后外周血IL-10、TGF-β蛋白表达

3 讨论

哮喘是严重危害人类健康的常见呼吸系统疾病，发病率逐年增高。目前全球约有3亿多人受到哮喘的困扰。我国儿童哮喘流行病学调查显示儿童哮喘患病率从1990年的1.09%上升到2010年的3.0% 以上[3]，其中过敏性哮喘占儿童哮喘的 80%以上[6]。

“四位一体”治疗方案是WAO推荐的过敏性疾病的治疗方案。包括环境控制、对症治疗、AIT以及患者教育。AIT是通过给予患者剂量逐渐增加的过敏原而使患者达到对过敏原耐受的治疗方法。至今已经有近100年的历史，是目前GINA推荐的唯一可能改变过敏性疾病自然进程的对因治疗。尤其是关于SCIT研究较多，但其发挥治疗作用的机制尚不是十分清楚。

Breg 是一组有免疫调节功能的细胞群，主要通过分泌具有免疫抑制作用的可溶性细胞因子及通过细胞表面细胞因子参与建立免疫耐受，在免疫稳态的调节中发挥至关重要的作用[7]。根据Breg 表面分子及其分泌的细胞因子将Breg分为不同的细胞亚型，在人类主要的亚型有[8-9]:(1)记忆 Breg(memory Breg)，CD19+CD24highCD27+IL-10+Breg，以 CD27 为免疫细胞标志，通过产生 IL-10，强有力地抑制细胞毒性T淋巴细胞以及单核细胞功能;(2)浆细胞性 Breg(plasma Breg)，CD19+CD24highCD38highCD138+IgM+Breg，以 CD138、IgM 为标志，产生过敏原特异性IgG和免疫抑制细胞因子，抑制树突状细胞和效应T细胞;(3)过渡性B细胞，表达CD19+CD24highCD38high，可抑制 Th1、Th17，诱导Tregs;(4)Br3，产生TGF-β;(5)杀伤性Breg(killer Bregs)，CD19+CD5+CD24highCD38highCD178+，可通过 Fas(表达于细胞表面的一种细胞因子，受体与Fas结合后启动死亡信号转导)诱导T细胞的凋亡。根据Breg分泌细胞因子也可分为产IL-10 Breg、产TGF-β Breg、产IL-35 Breg 等。研究发现 Bregs 在过敏性哮喘、过敏性鼻炎等过敏性疾病患者外周血中数量减少和功能受损[10-11]。本研究组前期研究发现儿童哮喘急性期 CD19+CD24highCD27+Breg比例降低、分泌IL-10功能减弱，同时细胞表面分子 CD80、CD86 表达下调，提示急性期哮喘患儿存在Breg数量减少及可能的功能异常[5]。

在AIT过程中，有研究报道患者外周血Breg数量及功能均有不同程度的恢复。Breg主要通过IL-10抑制效应T细胞的功能、抑制树突状细胞成熟、诱导Treg分化和特异性IgG4产生进而参与AIT耐受的诱导。除此之外，Breg还能分泌多种可溶性分子，如抗炎细胞因子IL-1β、IL-35、IL-21和TGF-β，这些分子与相邻免疫细胞的细胞表面受体结合，触发细胞内部信号级联反应，调节基因转录、翻译，间接调节免疫细胞的活性[12,8]。Boonpiyathad等[13]发现在接受AIT治疗的25例过敏性哮喘成人患者中，治疗2年后应答者外周血产生IL-10 Breg细胞的数量高于未应答者。Boonpiyathad等[14]还比较了14例接受蜂毒免疫疗法(venom Immunotherapy，VIT)的蜂毒过敏患者的外周血Breg，发现VIT治疗3～4个月后产IL-10 特异性Breg(CD73-CD25+CD71+Br1)数量升高2～5倍。

本研究方案采用的SCIT总疗程为3～5年，分为剂量递增阶段和剂量维持阶段，剂量递增阶段时间为4～6个月左右。对接受SCIT治疗的患儿进行治疗前与剂量递增阶段完成后Breg数量及CD4+T淋巴细胞不同细胞亚群(Th1、Th2、Th17、Treg)数量、相关细胞因子表达变化进行研究。发现与SCIT治疗前相比，剂量递增阶段结束时CD19+CD24highCD27+Breg比例、CD19+B细胞中IL-10 mRNA表达水平、外周血IL-10蛋白表达水平均有明显的升高；TGF-β mRNA表达虽有升高，但未见统计学意义。提示IL-10可能在SCIT剂量递增阶段免疫耐受的建立中发挥重要作用，TGF-β并不是最主要调控因子。

IL-10、TGF-β是Bregs主要的分泌因子，在过敏性炎症的免疫耐受过程中，Breg产生TGF-β、IL-10，后者进一步作用于Tregs，增强Treg应答，抑制效应T细胞Th1、Th2、Th17的活化，抑制慢性炎症，这一过程以IL-10依赖的方式进行[2]。细胞因子IL-10是调节免疫反应和防止过度炎症的关键因素，Breg产生的IL-10对不同类型的细胞均具有广泛的抑制作用。Breg依靠IL-10抑制Th1、Th2细胞的分化和产生，下调Th1细胞产生IL-2和IFN-γ细胞因子，下调Th2细胞分泌功能，抑制树突状细胞和巨噬细胞的活性，促进T细胞的凋亡。Breg也通过IL-10，联合TGF-β、IL-35促进Th0细胞向Foxp3+Treg转化，并促进其表面CTLA-4的表达，引起免疫耐受。

本研究real-time PCR发现Th1相关的细胞因子T-bet mRNA， Th2相关细胞因子GATA3 mRNA、Th17 相关细胞因子RORγt mRNA在SCIT剂量递增阶段结束后表达下调，提示在SCIT剂量递增阶段Breg可能参与下调Th1、Th2及Th17的分泌功能。但Treg相关的Foxp3+mRNA的表达变化没有统计学意义，同时FACS检测的Treg比例也没有明显变化。这些结果也提示，在SCIT剂量递增阶段Treg可能在螨虫特异性免疫耐受建立阶段并没有发挥主要作用。

虽然有研究发现在AIT免疫耐受建立过程中Treg发挥主要作用，但最近的研究提示AIT早期CD25+Foxp3+Treg的变化并不明显，提示在AIT早期Treg并没有发挥主要的免疫调节作用[15-17]。Zissler等[18]发现剂量递增阶段效应Th1、Th17细胞和CCR6+IL-17+Foxp3+Treg细胞减少，Th2细胞增加；治疗3年后剂量维持阶段Treg增加，而Th2和Th17应答减少。Xian等[15]研究67例尘螨过敏鼻炎伴或不伴哮喘的患者，接受螨虫特异性免疫治疗半年时，外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg升高不明显，而在治疗1年后明显升高。另外一些研究则得出了相反的结果。Moed等[16]研究了53例过敏性鼻炎儿童临床及免疫性指标，发现AIT治疗2年后过敏症状有所减轻，但未观察到IL-4、IL-5和IL-13以及调节性细胞CD4+CD25+Foxp3+Treg变化。因此关于效应T细胞及Treg在AIT治疗中发挥的作用仍存在争议。

Bregs除了通过分泌细胞因子(IL-10、TGF-β、IL-35等)发挥免疫调节，还通过细胞之间接触机制(CD80、CD86、CD1d)等实现免疫调节[2]。本研究显示，在SCIT剂量递增阶段，Breg相关表面因子(CD80、CD86、CD1d)并未出现明显的改变，提示在SCIT早期，细胞间的接触机制可能并不是Breg细胞发挥作用的主要方式。

综上，本研究发现螨虫过敏哮喘患儿接受SCIT时，在剂量递增阶段是以Breg数量升高及IL-10介导的免疫调节为主，Treg、TGF-β及细胞间接触抑制在此阶段可能并未发挥关键作用。但本研究存在一定局限，如纳入的研究样本量较少；仅对AIT剂量递增阶段的Breg等进行了相关研究，未将AIT临床疗效进行相关分析、未能设计非免疫治疗组患者进行对照研究等。

致谢：感谢深圳市儿童医院肺功能室刘萍副主任护师对本项目的支持。