寡糖·链蛋白浸种对菜豆根腐病的防控效果

陈利民， 吴倩倩， 何天骏， 潘逸明， 陈婷婷， 吴全聪*

(1.丽水市农林科学研究院，浙江 丽水 323000； 2.福建农林大学 闽台作物有害生物生态防控国家重点实验室，福建 福州 350002；3.浙江农林大学 农业与食品科学学院，浙江 杭州 311300； 4.丽水学院 生态学院，浙江 丽水 323000)

菜豆(PhaseolusvulgarisL.)作为我国食用豆科作物种植面积排名前三的作物，广泛种植于全国各种植区。自古以来，菜豆在我国传统农业和可持续农业的种植体系中均发挥着重要的作用[1]。但是随着规模化种植年限的增加，种植面积的不断扩大，以及近年来新品种育种过分追求产量目标而忽略了对抗病虫种质资源的利用和保护，致使由腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxyporum)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、链格孢(AlternariaNees)、疫霉(Phytophthora)、齐整小菌核(Sclerotiumrolfsii)、禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)等病原菌单独或复合侵染引起的根腐病发生呈逐年加重趋势[2]，已严重影响到世界各菜豆种植区的菜豆产量。据报道，我国部分菜豆种植区由根腐病引起的菜豆损失高达84%，部分非洲种植区高达100%[3]。

菜豆根腐病初发病时主根上出现红色至棕色条纹，逐渐形成损伤和坏死。随着菜豆植株的生长，开花结荚后症状逐渐明显，根腐病呈逐渐加重趋势，表现为菜豆植株自基部叶片开始枯萎发黄，最终导致根部完全腐烂。当前实际生产过程中多以化学药剂防控为主，但是由于镰刀菌针对性药剂偏少，且菜豆根腐病多为多种病原菌复合侵染所致[4]，致使传统化学防控效果普遍偏差。不仅如此，在菜豆根腐病的防控过程中，多以化学药剂直接灌根为主，大量化学药剂直接施用于土壤中，极易对生态环境造成不可逆的严重污染，甚至危及人类健康和生命安全。作为一种新型的植物病虫害防控策略，植物免疫激活调节剂的应用受到越来越多的关注，其中尤以6%寡糖·链蛋白应用最为广泛，并且在小麦、水稻、烟草、西瓜、葡萄等作物上均有较好的应用与推广[5-10]，在菜豆及根腐病防控方面鲜有报道。基于此，本研究分别用6%寡糖·链蛋白20、80、200、500、1 000倍液浸泡种子，对菜豆根腐病防控效果及抗性相关酶活力的影响进行了系统比较，以期为科学、绿色防控菜豆根腐病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料及处理

6%寡糖·链蛋白(阿泰灵)植物免疫激活剂由中国农业科学院植物保护研究所廊坊农药中试厂提供。试验所用试剂均为分析纯级，所用水为超纯水(ddH2O)，化学品从上海生工生物科技有限公司(上海，中国)或Sigma Chemical Do.(St. Louis，MO，USA)购买。所用菜豆品种为丽芸2号，盆栽所需土壤取自菜豆连作5 a以上且根腐病发生严重田块，土壤阴至微干后过5目筛备用。

本试验培养条件同6%寡糖·链蛋白诱导菜豆抗根腐病效果比较步骤。试验处理前种子均采用清水于28 ℃下浸种12 h，选取吸水充分，且无损伤的种子用于试验。试验设6个处理，T1为6%寡糖·链蛋白20倍液、T2为6%寡糖·链蛋白80倍液、T3为6%寡糖·链蛋白200倍液、T4为6%寡糖·链蛋白500倍液、T5为6%寡糖·链蛋白1 000倍液、CK为清水浸泡种子10 min。各处理浸泡完成后，于定性滤纸上晾干后用于播种，每组处理20盆盆栽菜豆，设置3个生物学重复。本试验于昼/夜温度为(25±1)℃/(18±1)℃，光周期L/D为16 h/8 h，相对湿度为60%±5%的环境下进行。播种后每天检查种子萌发情况并记录，并于出苗后14 d检查各处理幼苗根腐病发病病情指数。

1.2 测定内容及方法

播种间隔12 h记录菜豆出苗情况，计算出苗率。在菜豆出苗后7 d，随机挖取9株测量根系长度。采用SPAD-502 Plus叶绿素测定仪测叶绿素含量，每片叶片各测5个点，随机调查9株。于播种后9 d采集菜豆根系、叶片，液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱，用于测量根系活力及各类抗性相关酶活性。将完整的根洗净，用滤纸蘸去其上的水分，采用TTC法测定其根系活力[5]。β-1,3-葡聚糖酶的测定方法参考余永廷[11]的方法，用葡萄糖为标准品制作标准曲线，得到标准曲线方程为Y=1.552x-0.047(R2=0.994)，根据曲线计算样品产生的葡萄糖量。多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的测定参照棉花的测定方法[12]。几丁质酶活性检测参照左豫虎[13]对大豆的测定方法。

菜豆根腐病分级标准参照芸豆根腐病分级标准[3]。0级：植株茎基部和主根均健康无褐色病斑；1级：茎基部和主根上有少量褐色病斑；3级：茎基部或主根上褐色病斑较多，褐色病斑面积占茎和根总面积的25%～50%；5级：茎基部及主根上病斑多且较大，病斑面积占茎基部和根总面积的51%～75%；7级：茎基部或主根上病斑连片，形成绕茎现象，但根系并未死亡失活；9级：根系坏死，植株地上部萎蔫或死亡。

1.3 数据统计与分析

试验所得数据采用统计分析软件SPSS 19.0(SPSS Inc.，Chicago，IL)与Microsoft Excel 2010进行。

2 结果与分析

2.1 对菜豆出苗率的影响

经不同浓度6%寡糖·链蛋白浸种后菜豆出苗率存在差异。出全苗前，随着时间的延长，各处理出苗率均不同程度低于CK。播种后12 h各处理均无菜豆出苗；24 h CK出苗率达100%，且与T1和T2存在显著性差异，其他各处理出苗率均达80%以上，且与T1存在显著性差异；36 h T5出苗率亦达到100%，此时除T1外其他各处理出苗率均达90%以上，且T1出苗率显著性低于其他各处理；48 h T4出苗率亦达到100%，T1出苗率为80.6%，为各处理出苗率最低，且显著低于T2、T4、T5和CK(表1)。

表1 不同浓度6%寡糖·链蛋白浸种后菜豆的出苗率

2.2 对菜豆生理指标的影响

叶绿素含量各处理间无明显差异，以T1和T2含量相对较高。各处理间根系长度虽无显著性差异，但以T5和T4根系相对较长，且各试验处理根系均长于CK。各处理间根系活力差异相对较大，随着稀释倍数的增加，根系活力呈现先减少后增加的趋势，其中T3根系活力显著性低于T1、T5和CK，同时CK根系活力显著性高于T4(图1)。

柱上无相同字母者表示组间差异显著(P<0.05)。

2.3 对菜豆抗性相关酶活的影响

在出苗后7 d经不同稀释倍数6%寡糖·链蛋白浸种处理后播种的菜豆幼苗，在抗性相关酶活性方面存在较大差异。CK、T2和T3的菜豆叶片中，β-1,3-葡聚糖酶活性显著高于T1和T5，在根部表现出相似的趋势；随着稀释倍数的增加菜豆叶片和根部PPO酶活性呈下降趋势，且各试验处理均显著性高于CK；随着稀释倍数的增加菜豆叶片POD酶活性呈下降趋势，其中T1和T2显著高于CK和T5，在根部该酶活性以T3和T4最高，且显著高于其他各处理，同时T1和T2亦显著高于CK；

PAL活性在各试验处理间差异不显著，仅在菜豆根部T3显著高于CK，其他各试验处理虽均高于CK，但差异不显著；在菜豆叶片内几丁质酶的活性以CK最高，T2和T5次之，T1、T3和T4活性相对较低，其中CK显著高于T1、T3和T4，在菜豆根部该酶的活性以CK和T5最高，T3和T4次之，T1和T2最低，CK显著高于除T5外的各试验处理(表2)。

表2 不同浓度6%寡糖·链蛋白浸种对菜豆抗性相关酶活的影响

2.4 对菜豆根腐病防控效果的影响

经不同浓度6%寡糖·链蛋白浸种处理后播种，出苗后15 d，各试验处理组病情指数均显著低于CK，同时亦表现出不同的防治效果。T1对菜豆根腐病的防治效果最佳，防治效果可达50%左右，T2次之，其他各试验处理防治效果为30%左右，其中T1与除T2外的其他各处理均形成了显著性差异，同时各试验处理对菜豆根腐病的防效均显著高于对照处理。

表3 不同浓度6%寡糖·链蛋白浸种对菜豆根腐病防控效果的影响

3 小结与讨论

6%寡糖·链蛋白可湿性粉剂—阿泰灵，自登记以来在水稻、西瓜、葡萄、茶叶等多种农作物及水果上均有应用报道，在抗病抗虫方面均有较好的应用效果，但其在菜豆上的应用，以及作为种子处理剂的应用鲜有报道。本研究以20、80、200、500、1 000倍的6%寡糖·链蛋白可湿性粉剂稀释液浸泡菜豆种子，对出苗率、根系长度、叶绿素含量、根腐病防治效果、抗性相关酶活性等进行了分析比较，以期初步明确6%寡糖·链蛋白可湿性粉剂作为种子处理剂在菜豆上的使用方法，及对根腐病的防控机理。

结果表明，各稀释倍数的6%寡糖·链蛋白可湿性粉剂浸泡菜豆种子，对菜豆根腐病均有显著性防治效果，其中稀释20倍对菜豆根腐病防控效果最佳，且显著性优于其他各处理，其次为稀释80倍和500倍，稀释200倍和1 000倍效果相对一般，与CK相比防治效果均低于30%。但是，在对各稀释倍数的6%寡糖·链蛋白可湿性粉剂浸泡菜豆种子的出苗率进行统计分析后发现，6%寡糖·链蛋白可湿性粉剂浸泡菜豆种子对种子发芽有一定抑制作用，并且稀释20、80和200倍能够显著性降低菜豆的出苗率，这与张强等[7]在水稻上的试验结果有一定差异，可能与本试验采用浸种的6%寡糖·链蛋白浓度过高有关。为了进一步研究各稀释倍数的6%寡糖·链蛋白可湿性粉剂浸泡菜豆种子对菜豆幼苗可能造成的影响，本试验同时对播种后9 d的菜豆幼苗叶绿素含量、根系活力等指标进行了统计分析。结果表明，各稀释倍数的6%寡糖·链蛋白可湿性粉剂浸泡菜豆种子对菜豆幼苗无明显抑制作用。

PPO和POD是植物体内广泛存在的抗性相关活性酶[14]，能增加植株幼嫩组织的木质化程度及醌类化合物形成，构成保护性屏障而使细胞免受病菌的侵害，也可以通过形成醌类物质直接发挥抗病作用。亦可通过催化作用，将植物细胞内多余的H2O2还原为H2O。作为苯丙烷类代谢中最为重要的代谢催化酶[15]，PAL可催化形成包括植保素、木质素和酚类化合物等抗病次生物质。β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶可以降解大多数真菌细胞壁[16-18]，阻止或中断真菌在植物体内的侵染、定殖和扩展，在抗真菌病害的研究方面亦受到广泛关注。本研究表明，不同稀释倍数的6%寡糖·链蛋白浸种，对菜豆苗期叶片和根部的PPO和POD均有一定的诱导上调作用，这与盛世英等[5]在小麦上的研究以及李培玲等[19]在马铃薯上的研究相一致，而在PAL、β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶3个抗性相关酶活性方面无明显变化规律，这说明6%寡糖·链蛋白可通过激发PPO和POD 2个关键抗性相关酶活性，从而产生防御反应，这是诱导菜豆抗根腐病的重要机制之一。

综上研究结果表明，6%寡糖·链蛋白可湿性粉剂浸泡菜豆种子，能够激发菜豆幼苗的抗病性，减少病害发生，保障菜豆健康生长，是菜豆安全生产中的绿色防控方法。在稀释倍数方面，以500倍稀释液浸种效果最佳，浓度过高会抑制菜豆种子的萌发，降低出苗率。在抗病机制方面，6%寡糖·链蛋白可湿性粉剂可显著提高菜豆中具有广谱抗病功能的PPO和POD等抗性相关酶活性，能够激发菜豆广谱抗病性，不仅对根腐病具有较高防治效果，同时对其他病害亦有一定防控作用。