杭州地区葡萄炭疽菌的分离与生物学特性

肖文斐， 柴伟国， 忻雅， 来文国， 阮松林， 裘劼人

(杭州市农业科学研究院，浙江 杭州 310024)

葡萄汁多味美、营养丰富，是我国的主要果品之一，也是杭州地区的主栽水果。目前，杭州市葡萄种植面积约为1 300 hm2[1]。葡萄炭疽病是一种分布广泛的重要病害，给生产带来巨大损失[2-3]。引起葡萄炭疽病的病原主要为胶孢炭疽菌，存在丰富的遗传多样性，不同地区、不同栽培条件下菌落形态、菌落生长速率、产孢量、致病力等差异显著[4-6]。因此，本研究通过对杭州地区葡萄炭疽菌的分离和生物学特性的分析，为当地该病害防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病原菌的分离与鉴定

在杭州市临安区横街村葡萄园采集具有葡萄炭疽病典型病症的叶片和果实，用自来水洗净表面，再用75%乙醇消毒1 min，1%次氯酸钠消毒10 min，无菌水冲洗3遍，置于无菌滤纸上吸干表面水分。切取叶片或果实病健交界处无明显病变的组织，于马铃薯葡萄糖培养基上25 ℃黑暗培养。培养5 d后，用无菌接种针挑取平板上菌丝及分生孢子进行显微观察，拍照记录菌落数量及孢子生长状态。将鉴定正确的菌株在马铃薯葡萄糖培养基上纯化培养，用于后续生物学特性研究。

1.2 不同培养基对菌落生长及产孢的影响

配置马铃薯葡萄糖培养基、马铃薯蔗糖培养基、葡萄糖蛋白胨培养基、蔗糖蛋白胨培养基、酵母葡萄糖产孢培养基共计5种培养基。在无菌条件下用打孔器将纯化培养7 d的病原菌打成直径为5 mm的菌饼，接种到不同营养类型培养基上，每个处理设置3个重复，置于25 ℃恒温条件下培养。逐日测量菌落直径，观察菌落生长状况，7 d后用血球计数板计测病菌产孢量。

1.3 不同pH值对菌落生长及产孢的影响

以马铃薯葡萄糖培养基为供试培养基，用1 mol·L-1HCl和1 mol·L-1NaOH调配成3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 7个不同pH值的培养基。在无菌条件下用打孔器将纯化培养7 d的病原菌打成直径5 mm的菌饼，接种到不同pH值的培养基上，每个处理设置3个重复，置于25 ℃恒温条件下黑暗培养，逐日测量菌落直径，观察菌落生长状况，7 d后用血球计数板计测病菌产孢量。

1.4 光照对菌落生长及分生孢子的影响

在无菌条件下用打孔器将纯化培养7 d的病原菌打成直径5 mm的菌饼，接种到马铃薯葡萄糖培养基(pH 6.0)上，25 ℃恒温条件下分别进行黑暗及光照培养，逐日测量菌落直径，观察菌落生长状况，7 d后用血球计数板计测病菌产孢量。

1.5 数据统计分析

使用DPS 16.05统计分析软件对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 葡萄炭疽菌的分离及形态鉴定

随机选取多份甬优1号葡萄发病果实进行病原菌的分离纯化培养，共获得5个纯菌落，经形态学观察发现：菌落在马铃薯葡萄糖培养基平板上呈圆形或近圆形，初期正面菌丝为灰白色，背面为深灰色，边缘橙黄色。培养10 d左右，代谢产物大量积累，菌落背面有大量黑色素形成的同心轮纹或斑块，中央有少量黑色素生成，产生分生孢子盘，分生孢子溢出形成橘红色黏孢子团。分生孢子呈现圆柱形或椭圆形，无色单胞，长轴为10.0～15.0 μm，短轴为4.0～6.0 μm。从孢子形态、大小及附着胞形态等特征可推断杭州葡萄炭疽病的病原菌为胶孢炭疽菌(图1)。

图1 菌株在马铃薯葡萄糖培养基上的菌落及孢子形态

2.2 不同培养基对葡萄炭疽菌生长及产孢的影响

病原菌菌丝在马铃薯葡萄糖培养基上长势最好，菌丝厚重生长快，产孢能力强；其次为马铃薯蔗糖培养基，菌丝生长也较为致密，产孢较多；而酵母葡萄糖培养基，菌丝生长稀疏，初始产孢多，后续产孢少，且分生孢子形态更为细长。葡萄糖蛋白胨与蔗糖蛋白胨培养基类似，菌丝生长较慢，产孢能力差；其中蔗糖蛋白胨培养基产生的分生孢子有15%左右的畸形率(表1)。葡萄糖作为碳源，比蔗糖更有利于该菌株的生长与产孢。

表1 不同培养基对葡萄炭疽菌生长及产孢的影响

2.3 培养基不同pH值对葡萄炭疽菌生长及产孢的影响

比较发现，该菌株在pH 5.0～9.0的马铃薯葡萄糖培养基生长和产孢情况良好，其中pH值7.0和8.0最为合适，菌丝生长和产孢情况最佳，而pH值4.0以下菌丝生长缓慢，也不利于产孢(表2)。

表2 培养基不同pH值对葡萄炭疽菌生长及产孢的影响

2.4 光照对葡萄炭疽菌生长及产孢的影响

光照培养更能促进该菌株的菌丝生长和产孢，但与黑暗培养差异不显著(表3)。

表3 光照对葡萄炭疽菌生长及产孢的影响

3 讨论

研究表明，胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌等多种病原真菌可引起葡萄炭疽病[7]，在我国胶孢炭疽菌是引起葡萄炭疽病的优势种。目前北京、山东、河北、河南、广西、新疆及辽宁等葡萄产区鉴定的葡萄炭疽病病原均为胶孢炭疽菌[8]，宗宇等[9]也确定了引起金华地区葡萄炭疽病的病原菌为胶孢炭疽菌。本研究分离的杭州地区葡萄炭疽菌，在菌丝形态特征上与金华菌株不太一致，其菌落和分生孢子形态更接近邓维萍等[10]分离的云南地区C组葡萄炭疽菌。

本研究分离的病菌在马铃薯葡萄糖培养基上菌丝生长最好，产孢量最大。以葡萄糖作为碳源比蔗糖更利于病原菌生长和产孢。该菌在pH 3.0～9.0菌丝能够生长，在pH 4.0～9.0能够产生分生孢子，其生长适宜pH是5.0～9.0，菌丝生长最适pH为7.0，pH 8.0最适合其产孢，这与新疆葡萄炭疽病菌最适pH 6.0有所不同[11]。

胶孢炭疽菌具有复合种和种群集合的特征，前人的研究表明该复合种群种内遗传分化导致其多样性丰富[12]，这可能是本研究与文献[9,11]研究结果不一致的原因之一。后续将通过rDNA-ITS序列分析等方法对该菌株进行分子验证，以进一步明确其分类地位。