温度及光照对4种饵料微藻生长的影响

李腾腾， 王紫薇， 任鹏， 蓝天一， 邵艳卿， 方军*

(1.浙江省海洋水产养殖研究所浙江省近岸水域生物资源开发与保护重点实验室 温州市海洋生物遗传育种重点实验室中国水产科学研究院海洋贝类工程技术研究中心，浙江 温州 325005； 2.宁波大学，浙江 宁波 315211)

近年来，我国贝类、虾类等养殖快速发展，苗种需求旺盛。2017年我国虾类育苗量为12 518亿尾，比2016年(10 752亿尾)同比增长16.42%，其中南美白对虾2017年为9 552亿尾，比2016年(8 028亿尾)同比增长18.97%；2017年贝类育苗量248 406亿粒，比2016年同比增加4%[1]。虾类和贝类育苗过程中的关键因素是水质和饵料[2]，而水质受地理环境、气候变化和经济活动等的影响，人为调控能力较弱，因此，饵料微藻的选择及培养关系着虾、贝苗种繁育和养殖生产。

微藻几乎是贝类幼苗唯一的饵料选择[3]，影响着贝类的营养、生理和繁殖[4]。微藻是体形微小(2～30 μm)、能进行光合作用的低等植物的总称，具有可利用光能、生长繁殖快、对环境适应性强和易培养等特点[5]。常见的饵料微藻约有20多个属、40多个种，包括硅藻、金藻和绿藻等种类，除应用在贝类和虾类的育苗过程外，还广泛应用于浮游动物如轮虫、桡足类等的培养[6]。不同种类的微藻有着不同的适宜培养条件，目前国内外关于环境因素对微藻生长影响的研究很多[7-10]，但大多停留在试验室阶段，生产培养相关方面的研究鲜有报道。

本试验选取威氏海链藻9021(Thalassiosiraweissflogii)、牟氏角毛藻(Chaetocerosmuelleri)、湛江叉鞭金藻(Dicrateriazhanjiangensis)以及亚心形扁藻(Platymonassubcordiformis)4种生产培养上较为常见的饵料微藻进行二级扩大性培养，探究培养水体温度和外界光照强度对饵料微藻繁殖生长的影响，以期为浙江沿海地区虾、贝等水产经济动物的人工育苗提供饵料微藻培养的坚实依据，为不同季节、梅雨、高温、台风等恶劣天气条件下微藻种类选择及培养策略提供技术性指导。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用藻种威氏海链藻9021株系由宁波大学海洋学院提供，牟氏角毛藻、湛江叉鞭金藻和亚心形扁藻株系由浙江省海洋水产养殖研究所清江试验基地藻种库提供。

1.2 培养方法与条件

培养液母液配置按“宁波大学3号”配方配置，NaNO3100 g，K2HPO410 g，FeSO4250 mg，MnSO425 mg，Na2EDTA 10 g，VB10.6 mg，VB125 μg，海水1 000 mL。

试验所用海水为二级沙滤海水，经10 g·m-3漂白粉清洗并暗处理至少24 h进行消毒。接种前加入3 g·m-3的Na2S2O3并充分曝气，使用余氯试剂盒检测水体中余氯残留，待水体中有效氯完全中和后接种。试验使用容器为50 L塑料桶，先用高锰酸钾溶液消毒，再经消毒水冲洗2～3次干燥后备用，尼龙薄膜和充气管煮沸高温消毒。

在50 L塑料白桶中加入30 L已完全中和的消毒海水，并加入50 mL培养液母液，取处于对数生长期的藻种接种，同时设置3个平行组，并测定微藻的起始培养浓度。然后用透明尼龙薄膜封口，自然光照下，充气一次性培养，每天使用温度计和照度计监测水温与光照强度变化，及时调节温度(通过移位至阴凉通风处或用加热棒升温)和光照强度(通过调节遮阴网以达到试验要求)。

1.3 温度试验

设置5个温度梯度：17～20 ℃、20～23 ℃、23～26 ℃、26～29 ℃、29～32 ℃。光照强度为10 000～20 000 lx，海水盐度为18‰，pH为8.1～8.3。

1.4 光照试验

光强过高会造成微藻的死亡，结合浙江当地降雨情况(阴雨天实际光照强度为980～10 180 lx，晴天实际光照强度为9 700～76 600 lx)，通过调节遮阴网的密度将光照调控在20 000 lx左右，将光照分为两个梯度，阴天为1 000～10 000 lx，晴天为10 000～20 000 lx，水体温度26～29 ℃，海水盐度为18‰，pH为8.1～8.3。

1.5 温度和光照的正交试验

对威氏海链藻9021株以及湛江叉鞭金藻进行正交试验。设置5个温度梯度(17～20 ℃、20～23 ℃、23～26 ℃、26～29 ℃、29～32 ℃)和两个光照强度(1 000～10 000 lx和10 000～20 000 lx)的正交试验，海水盐度为18‰，pH为8.1～8.3。

1.6 比生长率的计算

每天固定上午10:00取样，用Lugol碘液固定，在显微镜下使用血球计数板计数并计算生物量，每个样品计数3次，取平均值。通过公式μ=(1nXt-lnX0)·t-1计算比生长率，其中X0指初始藻类细胞数量，Xt指td后藻类细胞数量。

2 结果与分析

2.1 温度对微藻生长的影响

不同温度条件下4种饵料微藻的生长曲线如图1所示。4种饵料微藻的生长周期和最大生物量均随温度的变化而变化，4种饵料微藻自接种第2天生物量均有显著增长，达到最大生物量后维持几天，之后迅速进入衰败期。微藻与其他水生生物一样，对水环境的温度有一定的适应性，过高或过低的温度均会抑制微藻的生长，水体温度过高甚至会造成微藻的迅速死亡。有些研究者认为对于光合自养生物而言，当超出适宜温度范围时，温度主要是通过控制物质与能量代谢过程中酶的动力学来影响其生长，此外，超出适温范围的温度对于微藻的伤害作用可能是由于出现了不同程度的质壁分离[11]。

图例温度条件后无相同小写字母者表示组间差异显著(P<0.05)。

从本试验的结果可以看出，温度对4种饵料微藻的生长有显著影响。湛江叉鞭金藻在17～29 ℃均可正常生长，温度高于29 ℃时，尽管比生长率获得最大值，但其生长明显受到抑制；牟氏角毛藻在17～32 ℃时可正常生长，因此属于广温种，在26～32 ℃能快速到达平台期，在17～26 ℃时生长则受到一定程度的抑制；威氏海链藻9021在17～32 ℃均可正常生长，同样为广温种，在高温和低温下均能快速生长；亚心形扁藻在17～26 ℃能快速生长且具有较高的最大生物量，高于26 ℃时生长则受到一定程度的限制，当温度高于29 ℃时生长明显受到抑制。

2.2 光照强度对微藻生长的影响

光照是微藻生长必不可少的，但过高的光照会对藻细胞造成一定程度的伤害，过低的光照则很大程度上抑制藻细胞的生长。不同光照强度下4种饵料微藻的生长曲线如图2所示。结果表明：光照强度对4种饵料微藻生长有显著影响。随着光照强度的增加，牟氏角毛藻、湛江叉鞭金藻和亚心形扁藻的最大生物量均有所增加，且比生长速率有显著差异。有研究表明：光照强度越高，细胞分裂越快，生物量越大[12]。而威氏海链藻9021呈现出相反的现象，在阴天情况下生长要优于晴天。

图例光照条件后无相同小写字母者表示组间差异显著(P<0.05)。

2.3 温度和光照的正交试验

湛江叉鞭金藻在1、8、9、10等3组条件下有较大比生长速率，但由于其生物量受到严重的抑制，达不到实际生产过程中的需求，因此，我们认为26～29 ℃、10 000～20 000 lx是湛江叉鞭金藻大规模培养的适宜条件，此时比生长速率为0.396(表1、图3)。

表1 正交试验中湛江叉鞭金藻的比生长率

图3 湛江叉鞭金藻的最大生物量

威氏海链藻在温度26～29 ℃、光照强度1 000～10 000 lx试验组生长状况最好，比生长速率最大(μ为0.291)(表2、图4)，据此我们可以认为这是威氏海链藻9021的适宜培养条件。

表2 正交试验中威氏海链藻9021的比生长率

图4 威氏海链藻9021最大生物量

3 讨论

3.1 温度对微藻生长的影响

温度是影响微藻生长和繁殖的重要环境因子之一，微藻对温度的耐受能力因种类不同而存在巨大差异，各种藻类对温度的要求不同，有其各自的适应范围[13]。主要通过影响微藻细胞生理活动的活性和其对水体营养物质的利用率，这两种影响方式并存，是共同作用又相互竞争的关系[14]。申哲民等[15]研究表明，年均气温每增加1.0 ℃，年均藻类生物量会增加0.145倍，且水体富营养化程度越显著，温度升高对藻类生长的影响越大。从本试验的结果来看，虽然生产性培养的饵料微藻有些为广温性藻类，但生产中需要快速、高效地提供高浓度的藻液。因此，尽管有部分试验结果表明在29～32 ℃条件下湛江叉边金藻具有很高的比生长率，但达不到大规模培养所需要的生物量，因此，该条件并不是大规模生产的最佳培养条件。本研究发现，在26～29 ℃，10 000 lx～20 000 lx条件下湛江叉鞭金藻获得较大的比生长速率，同时具有较高的最大生物量，为大规模培养的最佳条件。春秋季的水温为17～26 ℃，适宜于大规模培养湛江叉鞭金藻、威氏海链藻9021以及亚心形扁藻作为水产苗种的饵料，牟氏角毛藻少量培养搭配使用。夏季高温期水温为26～32 ℃，适宜大规模培养威氏海链藻9021和牟氏角毛藻作为苗种的饵料。这与陈贞奋[16]关于牟氏角毛藻的研究结果相同，湛江叉鞭金藻可作为开口饵料小规模少量培养。

3.2 光照强度对微藻生长的影响

光照是单细胞藻培养中最重要的影响因子之一，浮游植物需要通过光合作用制造有机物维持自身生长、繁殖。浮游藻类生产量的季节变化与光照条件的季节差异有着直接关系，水生藻类光合作用的强弱，取决于透入水中的光照强度和光质[17]。对于光能自养的浮游植物而言，光能是一个不断变化的资源；很多种类浮游植物都表现出对光照相同的生理适应，即其生长速率随着光照强度从零到某一个适宜光照强度的增加而相应地增加[18]。本试验中湛江叉鞭金藻、牟氏角毛藻和亚心形扁藻在强光条件下(10 000～20 000 lx)的比生长率均明显大于弱光条件(1 000～10 000 lx)，而威氏海链藻9021在弱光条件下的比生长率明显大于强光条件，故为喜阴种，但最大生物量较高光组低，可能是由于随着生物量的增加，水体透光性降低，藻细胞对光的利用降低，减缓了细胞分裂[19]，从而抑制了生长。因此，威氏海链藻9021是一种在弱光条件下比较容易培养的饵料微藻，在江浙地区梅雨季节，连续阴雨天无法提供充足光照的条件下可以很好地替代角毛藻作为水产经济苗种中后期培育的饵料。

综上所述，温度和光照的变化会影响饵料微藻的比生长率和最大生物量，在适宜的温度、光照条件下培养合适的饵料微藻可以极大程度上加快饵料微藻的提供效率，从而减轻饵料供应不足的压力。据统计，浙江沿海一带春季阴冷多雨，平均温度维持在13～18 ℃，夏季为梅雨季，降水量充足，气温25～30 ℃；秋季气温变化较大，气温16～21 ℃，降雨量较少；冬季晴冷少雨，气候较干燥，气温3～9 ℃。因此，在了解不同饵料微藻的适宜培养环境的情况下，关注水体温度和光照变化，提前做好准备工作，可以有效防止饵料供应出现断层。