杀线虫解淀粉芽胞杆菌Sneb709与费氏中华根瘤菌Sneb183共培养发酵条件优化

李佳娣，赵劲捷，范海燕，朱晓峰，王媛媛，刘晓宇，段玉玺，陈立杰*

（1.沈阳农业大学植物保护学院，沈阳 110866；2.沈阳农业大学生物科学技术学院，沈阳 110866；3.沈阳农业大学理学院，沈阳 110866）

根结线虫可引起作物根系癌肿，造成蔬菜减产20%～30%，严重的可达60%～70%，甚至绝收，在全球造成的农作物经济损失可达10亿美元，是世界上危害最严重的土传病原物[1,2]。根结线虫寄主范围广，可以通过病土、病苗、病残体、农事操作等进行传播，常见种类南方根结线虫Meloidogyne incognita是我国温室蔬菜作物的优势种类，一旦进入温室土壤中很难清除，成为世界上最难防控的土传病害，也是困扰我国的蔬菜产业的重要生产问题。生物防治作为线虫病害综合治理措施中的一种环境友好型防治措施，近年来得到了发展[3,4]。

对根结线虫有效的生防菌筛选主要集中在真菌和细菌的研究上，早期研究多集中在真菌上，人们发现了淡紫拟青霉[5]、木霉菌[6]和聚多曲霉[7]等线虫生防真菌。近年来，又发现枯草芽胞杆菌[8]、苏云金芽胞杆菌[9]、巨大芽胞杆菌[10]、防御假单胞菌[11]和坚强芽胞杆菌[12]等对根结线虫有活性。

杀线活性物质的生成是这些生防菌株发挥防病功能的重要机制之一，而活性物质的种类、产量及生成效率直接影响菌株的实际生防效果。发酵是获得大量杀线活性物质的基础，对菌株发酵培养基和发酵条件进行优化可有效提高菌株的生防潜力。张洁等[13]分离到一株具有杀线活性的生防真菌粉红螺旋聚孢霉NF-06，并以产孢量为指标，优化其固体发酵条件后可有效防治根结线虫病。马喆[14]对微白黄链霉菌NZ-5的发酵条件进行优化后，其对南方根结线虫2龄幼虫的毒杀活性提高到93.29%，比优化前提高了8.93%。对淡紫拟青霉 KU8的固态发酵条件进行优化，能够提高其生物量，从而能更加有效地防治根结线虫[15]。何琼等[16]优化日本曲霉ZW1的发酵条件，确定其最优发酵条件，4 ℃保存一年的发酵液对南方根结线虫二龄幼虫的校正死亡率保持在87.8%。柳皓月等[17]优化芽胞杆菌SMrs28发酵条件，使该菌株分泌更多杀线虫活性的物质。Zhang等[18]通过响应面法优化长枝木霉菌T6的发酵条件，以其发酵滤液杀线虫活性为指标，优化后T6菌株的杀线能力可达到92.42%，比优化前提高了1.07%，并且在温室试验中对线虫的生防效果达到了83.33%。

单一的生防菌株一旦进入复杂的土壤环境，很难发挥良好的生防效果，因此，将2种或2种以上的微生物进行共培养，从而利用种群之间的协同代谢或诱导作用来得到纯培养条件下不能获得的产量、性状或新型物质[19]；或者利用共培养技术来挖掘新型抗生物质已经成为一种重要的手段[20]。解淀粉芽胞杆菌Sneb709 Bacillus amyloliquefaciens[21]和费氏中华根瘤菌Sneb183 Sinorhizobium fredii[22]均为本实验室前期筛选获得的具有杀线虫活性的生防菌株，本文将其进行共培养研究，并优化其培养基成分和发酵条件，旨在降低发酵成本、提高生防效果，为植物线虫病害的绿色防控提供更加高效的生防制剂。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 解淀粉芽胞杆菌Sneb709菌株和费氏中华根瘤菌Sneb183菌株，均由沈阳农业大学北方线虫研究所筛选、鉴定并保存。

1.1.2 供试线虫及其2龄幼虫的制备 南方根结线虫Meloidogyne incognita由沈阳农业大学北方线虫研究所南方根结线虫繁殖基地繁殖。选取受到根结线虫侵染严重的番茄根系品种Solanum lycopersicum L-402，购于辽宁园艺种苗有限公司，清洗干净后，使用眼科镊子挑取根结于装有适量0.5% NaClO溶液的孵化池中，静置1 min后使用无菌水冲洗3次，将孵化池装入灭菌的玻璃培养皿中并加入适量的无菌水，放入26℃暗室中培养，24 h收集南方根结线虫J2s，用于杀线虫活性测定试验。

1.1.3 供试培养基 LB液体培养基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，氯化钠10.0 g/L，加去离子水至1000 mL，pH 7.0。LB固体培养基：琼脂粉18.0 g/L，其余同LB液体培养基。YMB培养基：酵母提取物1.0 g/L，甘露醇10.0 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L，硫酸镁0.2 g/L，氯化钠0.1 g/L，氯化钙1.0 g/L，加去离子水至1000 mL，pH 6.8。YMA培养基：琼脂18.0 g/L，其余同YMB培养基。

1.2 菌株活化与共培养发酵液制备

将Sneb709从-80 ℃取出接种于LB固体平板上，28 ℃培养24 h后挑取单菌落接种于5 mL液体LB培养基中，28 ℃、180 r/min培养12 h，制备Sneb709种子液浓度为1×109CFU/mL。将Sneb183从-80 ℃取出接种于YMA平板上，28 ℃培养48 h后挑取单菌落于5 mL YMB培养基中，在28 ℃、180 r/min条件下培养48 h，制备Sneb183种子液浓度为1×109CFU/mL。取250 μLSneb709种子液与250 μL Sneb183种子液于5 mL液体LB培养基中，28 ℃、180 r/min、12 h，制备Sneb709与Sneb183共培养发酵液浓度为1×109CFU/mL。

1.3 共培养发酵液对南方根结线虫J2s的毒杀活性鉴定

取浓度均为1×109CFU/mL 的Sneb709发酵液、Sneb183发酵液以及Sneb709与Sneb183共培养发酵液各2 mL，用0.22 μm滤膜过滤，分别取650 μL滤液于24孔板中，加入50 μL J2s悬液约1000条/mL，以无菌水、LB培养基、YMA培养基为对照，将其放置于26 ℃的恒温箱中培养，12 h后在体式显微镜下（日本Nikon公司）观察并记录J2s的死亡数量，线虫的死亡判定标准为虫体僵直，并且使用毛针刺激后依然不活动，则判定线虫死亡。计算校正死亡率，共计5个处理，每个处理重复3次。线虫死亡率（%）＝（处理线虫死亡数－对照线虫死亡数）×100/对照线虫死亡数，线虫校正死亡率（%）＝（处理线虫死亡率－对照线虫死亡率）×100/（100－对照线虫死亡率）。共培养菌株发酵液发酵条件单因素筛选

1.3.1 发酵液培养基成分单因素筛选 以LB培养基为基础培养基，加入浓度均为1%的外源碳源、氮源、浓度为0.3%的外源无机盐制备成不同培养基成分的发酵培养基，其中外源碳源包括葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、山梨糖、甘露醇、可溶性淀粉、土豆淀粉、玉米淀粉；外源氮源包括牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、黄豆粉、花生饼粉、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、硫酸铵、磷酸二氢铵、尿素；外源无机盐包括硫酸镁、硫酸锰、硫酸锌、氯化钾、氯化钙、硫酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠。

在不同成分的发酵培养基中，接种750 μL Sneb709与Sneb183共培养发酵液于250 mL三角瓶中，每瓶中装有150 mL液体LB培养基，在28 ℃、180 r/min培养条件下培养12 h。取2 mL发酵液用0.22 μm滤膜过滤，取650 μL滤液于24孔板中，加入50 μL J2s悬液约1000条/mL，以无菌水以及LB培养基为对照，将其放置于26 ℃的恒温箱中培养，12 h后观察并记录J2s的死亡数量，计算校正死亡率，共计28个处理，每个处理重复3次。

1.3.2 影响发酵液培养条件单因素水平测定 用1.0 mol/L NaOH和1.0 mol/L HCl溶液调节培养基pH，使发酵初始pH分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0；在250 mL三角瓶分别装入25、50、75、100、125、150 mL培养基；将接种后的发酵液分别以140、160、180、200、220 r/min在28 ℃培养12 h；将接种后的发酵液放于28 ℃、180 r/min的摇床中分别培养12、16、20、24、28、32、36 h。12 h后统计J2s的死亡数量，计算校正死亡率，每个处理重复3次。

1.4 响应面法优化筛选共培养菌株杀线虫活性的发酵因素

通过 Plackett-Burman试验分析单因素中各因素中因子的差异显著性，选取较为显著因子。使用Desgin-Exper 8.0.6软件Factorial中Plackett-Burman对1.3进行设计。试验结果用Desgin-Exper 8.0.6软件进行分析确定影响发酵结果的重要因素；再根据结果确定主要因素的爬坡方向。在主要影响因素中，在原始基础上依次增加，以此设置最陡爬坡试验。在最陡爬坡试验中第1组：初始pH为5，装液量为75 mL，在28 ℃下培养；第2组：初始pH为6，装液量为100 mL，在30 ℃下培养；第3组：初始pH为7，装液量为125 mL，在32 ℃下培养；第4组：初始pH为8，装液量为150 mL，在34 ℃下培养

根据最陡爬坡试验结果，确定重要影响因子的响应中心点。以南方根结线虫J2s的校正死亡率为响应值，同时在单因素试验以及最陡爬坡试验的基础上,确定影响发酵结果的培养基成分为山梨糖、花生饼粉、黄豆粉三要素，影响发酵结果的培养条件为温度、pH、装液量三要素,使用Design-Expert 8.0.6软件设计了三因素三水平的响应面试验，其中设置培养基成分三要素不同浓度，共计 17组处理，影响培养基发酵条件的三要素温度（28 ℃、30 ℃、32 ℃）、pH（5、6、7）、装液量 7（5、100、125 mL），共计 17组处理，使用Desgin-Exper 8.0.6软件 Response Surface中 Box-Behnken设计进行因素优化试验，建立最佳发酵条件，并以1.3.1的方法验证其响应面法获得的预测值。

1.5 优化后的共培养菌株发酵滤液对南方根结线虫J2s的毒杀活性

对比在优化条件下培养的共培养发酵液和在未优化条件即原始发酵条件下培养的共培养发酵液培养基，未优化条件：培养基为LB液体培养基；培养条件为pH 7，在250 mL三角瓶中加入150 mL培养基，28 ℃下培养在180 r/min条件下，发酵12 h，以无菌水、LB培养基和YMA培养基为对照，验证优化后的共培养菌株发酵滤液对南方根结线虫J2s的毒杀活性。按照1.3.1的方法进行毒杀试验，分别取2 mL共培养优化发酵液和未优化发酵液用0.22 μm水系滤膜过滤，以无菌水、LB培养基以及YMA培养基为对照。共计3个处理，每个处理重复3次。

1.6 发酵罐验证优化条件

在上海百伦科技5联体离位灭菌机械搅拌玻璃发酵罐BLBIO-5GJ-5-H中使用共培养菌株在优化条件和原始条件进行发酵2个处理。优化发酵条件，即将LB培养基中加入山梨糖1.98 g/L、黄豆粉1.06 g/L、花生饼粉2.08 g/L制备成培养基，在温度为30.4 ℃、初始为pH 6.49、装液量为2.063 L；原始条件，即LB为培养基中在温度为28 ℃、初始为pH 7、装液量为3 L，对两种发酵液以1.3.1的方法进行毒杀试验，每个处理重复 3次。以无菌水以及LB培养基为对照，对使用发酵罐发酵对线虫的毒杀作用进行验证。

1.7 数据统计与分析

使用Microsoft Office Excel 2010 软件进行数据统计，使用SPSS statistics 23.0 软件进行试验数据的统计分析，试验采用Duncan 法P＜0.05进行差异显著性分析，使用GraphPad Prism 8.0.2作图以及标准误差分析。

2 结果与分析

2.1 共培养菌株发酵滤液对南方根结线虫J2s的毒杀活性测定

Sneb709与Sneb183共培养菌株发酵滤液对南方根结线虫J2s具有很强的毒杀活性，显著高于纯培养，其中Sneb709于LB培养基中培养，Sneb183于YMA培养基中培养，纯培养的培养基对J2s的活性影响不显著，处理12 h后，菌株Sneb709和 Sneb183的发酵滤液对J2s的校正死亡率分别为58.33%和17.08%，而共培养的发酵滤液对J2s的毒杀活性最高，校正死亡率为67.67%（图1）。

图1 共培养菌株与纯培养菌株发酵滤液对南方根结线虫J2s的影响Fig.1 Effect of co-cultured strain and pure culture strains culture filtrate on J2s of Meloidogyne incognita

2.2 两种菌株共培养的发酵培养基成分的单因素筛选

通过共培养菌株发酵滤液对南方根结线虫J2s的毒杀活性对发酵液培养基成分进行单因素筛选结果显示，碳源中山梨糖处理对J2s的校正死亡率达到78.16%，乳糖处理对J2s的校正死亡率为63.12%，山梨糖和乳糖的添加对J2s的影响较其他碳源影响显著。氮源中尿素处理对J2s的校正死亡率最高可达72.70%，其次为花生饼粉处理，对J2s的校正死亡率为65.71%，酵母膏和黄豆粉处理对J2s的毒杀活性虽不及前两个处理，但依然优于其他氮源成分，校正死亡率分别为46.70%和56.86%。无机盐中碳酸钙、硫酸镁、硫酸锌处理对J2s的毒杀活性较高，校正死亡率分别为70.89%、70.20%、75.63%（图2）。

图2 不同培养基成分的共培养菌株发酵滤液对南方根结线虫J2s的影响Fig.2 Effects of co-cultured strain culture filtrate of different component mediums on J2s of M.incognita

2.3 两种菌株共培养的培养条件单因素发酵

通过单因素筛选并确定最优培养条件的范围（图3），当pH值为2.0、3.0、4.0、10.0时，共培养发酵液对J2s的毒杀作用接近100%，说明过酸或过碱的条件不利于线虫生存；同时过酸或过碱的条件也不利于生防菌生存，在此条件下生防菌的浓度均不高于1×103CFU/mL；因此，这4个pH值条件不能选取为发酵生防菌的优化条件。当pH值为6.0时菌株，共培养发酵滤液对J2s的效果最好，死亡率为80.22%；250 mL的三角瓶中装液量为100 mL时的菌株共培养发酵滤液的毒杀活性最好，校正死亡率可达53.36%；此外，当转速达到120 r/min时，对J2s的校正死亡率为47.15%；温度为30 ℃时对J2s毒杀活性最好，校正死亡率为58.60%；当发酵28 h后对J2s的校正死亡率最高可达47.91%。

图3 不同培养条件的发酵液滤液对南方根结J2s的影响Fig.3 Effects of co-cultured strain culture filtrate on J2s of Meloidogyne incognita in different culture conditions

2.4 Plackett-Burman试验确定影响共培养发酵液培养基成分重要因素

根据发酵液培养基成分的单因素试验筛选结果，用Design expert 8.0软件处理不同因素水平下的PB试验设计（表1），并对12组结果（表2）分析各因素的显著性，该模型P＝0.0485的可信度水平也高于95%（P＜0.05），可知该模型在0.05水平上显著（表3）。因素E-花生饼粉P＝0.0122、D-黄豆粉P＝0.017和A-山梨糖P＝0.0419的可信度水平均高于95%（P＜0.05），说明这3个因素对共培养菌株发酵液毒杀J2有显著影响，其余因素可信度不高于95%，则说明其余因素对发酵液毒杀J2无显著影响。7个因子影响大小排序为花生饼粉＞黄豆粉＞山梨糖＞尿素＞酵母膏＞硫酸锌＞乳糖，故选取花生饼粉、黄豆粉和山梨糖进行下一步试验。

表1 共培养培养基成分Plackett-Burman设计的因素和水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design for co-culture medium components

表2 共培养培养基成分Plackett-Burman试验设计及结果Table 2 Design and results of Plackett-Burman test for co-culture medium components

表3 共培养培养基成分各因素效应值及其显著性分析Table 3 Effect values of various factors in co-culture medium and their significance analysis

2.5 不同成分发酵液培养基响应中心点确定

根据发酵液培养基成分的单因素试验筛选结果，设置最陡爬坡试验及路径结果（表4）表明，共培养菌株发酵液的最佳培养基组成成分为山梨糖1 g/L、黄豆粉1 g/L、花生饼粉2 g/L，对南方根结线虫J2s的校正死亡率最高，为65.89%，因此选择此点为响应中心点进一步进行Box-Behnken响应面试验。

2.6 影响共培养发酵液培养条件重要因素及响应中心的确定

根据不同培养基成分的单因素试验筛选结果,用Design expert 8.0软件对不同条件因素下的PB试验分析各因素的显著性，该模型（P＝0.0007）的可信度水平也高于95%（P＜0.05），可知该模型（P＜0.05）具有显著影响性。因素K-温度（P＝0.0004）、H-pH（P＝0.0029）和I-装液量（P＝0.0006）的可信度水平均高于95%，说明这三个因素对共培养菌株发酵液毒杀J2有显著影响，其余因素可信度不高于95%，则说明其余因素对发酵液毒杀J2无显著影响，并且该模型在0.01水平上极显著（P＝0.0007）。5个因子影响大小排序为温度＞pH＞装液量＞时间＞转速（表5）。

选取温度、pH和装液量进行最陡爬试验，设置4组不同培养条件（图4）结果表明，在第2组的培养条件下进行发酵对南方根结线虫J2s的校正死亡率最高，为58.15%，因此选择此点为响应中心点进一步进行Box-Behnken响应面试验。

图4 不同培养条件的发酵液滤液的最陡爬坡试验对南方根结J2s的影响Fig.4 Effects of Steepest climb test e on J2s of Meloidogyne incognita in different culture conditions

2.7 Box-Behnken响应面试验设计及结果分析

利用Design-Expert 8.0.6软件设计了三因素三水平的响应面试验以及其试验设计以及结果（表6）。通过软件数据方差进行分析，该模型在0.01水平上极显著（P＝0.0015），并且其失拟项不显著，由此可知，此模型的建立能够涵盖所有试验数据，而由试验误差导致的不能拟合情况可以忽略（表7）。得到校正死亡率 Y与影响发酵的重要培养基成分因素山梨糖(A)、黄豆粉(D)、花生饼粉(E)的回归方程：Y＝78.52－2.95A＋3.44D＋5.84E＋5.74AD＋8.11AE－1.20DE-10.12A2-13.29D2－17.21E2。

表6 共培养培养基成分Box-Behnken试验设计及结果Table 6 Co-culture medium composition Box-Behnken test design and results

表7 共培养培养基成分回归方程模型系数评估及其显著性检验Table 7 Coefficients of covariant medium composition regression equation model coefficients and significance test

通过对数据方差的分析得知该模型P＝0.0111，在0.05水平上显著，并且其失拟项不显著（表8），由此可知此模型的建立能够涵盖所有试验数据，而由试验误差导致的不能拟合情况可以忽略。通过软件进行回归拟合，得到校正死亡率%Y与影响发酵的重要培养条件因素温度（K）、pH（H）、装液量（I）的回归方程：Y＝66.92＋5.64K＋7.01H＋3.78L＋0.072KH－4.60KL＋0.11HL－13.4K2－7.69H2－11.84I2。

根据方程模拟结果，采用Design-Expert 8.0.6软件绘制响应面曲线和登高线曲面图都为凸面图（图5，6），说明有最高值，通过解析方程得到共培养发酵液毒杀活性最高时的培养条件：山梨糖0.98 g/L，黄豆粉1.06 g/L，花生饼粉2.08 g/L，温度30.4 ℃；初始pH 6.49，装液量103.15 mL。

图5 共培养发酵液培养基成分对J2s校正死亡率影响的响应面图与等高线图Fig.5 Response surface plots and contour plots of the effects of co-cultivation broth media components on J2s corrected mortality

图6 共培养发酵液培养基成分对J2s校正死亡率影响的响应面图与等高线图Fig.6 Response surface plots and contour plots of the effects of co-cultivation broth media components on J2s corrected mortality

2.8 优化后共培养发酵液的杀线虫效果

在优化条件下培养的发酵液对J2s的毒杀活性显著高于未优化共培养发酵滤液，在原始发酵条件下共培养处理12 h后对J2s的校正死亡率只有66.28%，优化后的校正死亡率达到84.17%，是原始发酵未在优化条件下的1.27倍（图7）。

图7 共培养发酵液在优化条件下培养对南方根结线虫J2s的影响Fig.7 Effect of co-culture fermentation broth on Meloidogyne incognita J2s under optimized conditions

2.9 利用发酵罐验证优化的发酵条件

利用优化后的发酵条件在发酵罐中进行发酵，并验证其杀线虫效果（图8）。在发酵罐中，采用优化条件来发酵的共培养发酵液滤液处理12 h 后对J2s的校正死亡率为74.03%，采用原始培养条件发酵的共培养发酵液对J2s的活性为50.31%。因此，优化后的发酵条件应用在发酵罐的发酵中，依然可以提高共培养发酵滤液对J2s的毒杀活性，是采用原始条件发酵的1.47倍。

图8 优化条件下共培养菌液发酵液在发酵罐中对南方根结线虫J2s的影响Fig.8 Effect of co-cultivation broth and fermentation broth on M.incognita J2s in fermenter under optimized conditions

3 讨论

生防菌产生的活性物质，是其防病的重要机制之一，而活性物质的含量与效率不仅菌株本身的遗传特性相关，也受到发酵条件的影响[23]。不同的生防菌株对培养基营养以及发酵条件的需求不同，因此需要对特定的菌株筛选适宜的培养基配方及发酵条件[24]。马永强[25]对生防菌株GD-9发酵条件进行优化确定其最

适的培养条件为菌剂商品生产化奠定基础。肖咪云等[26]通过单因素实验和正交实验对铜绿假单胞菌2016NX1的发酵条件进行优化，蓝色素的产量由原来的1.13 g/L，提升至1.42 g/L。本试验通过单因素优化法、响应面法BB设计对共培养菌株的培养基成分及发酵条件进行优化后，其对南方根结线虫J2s的校正死亡率达到84.17%，是未优化的1.27倍。

对生防菌的发酵条件进行优化可以提高其对线虫病害的防治效果，Brand等[27]通过优化淡紫拟青霉的固态发酵条件，提高其产胞量，从而提高对根结线虫的防治效果。曾庆飞等[28]优化链霉菌 DA07118发酵条件，优化后的发酵滤液根结线虫J2s死亡率从75.0%提高至93.7%。利用响应面法可以更好的研究碳源、氮源、无机盐等培养基成分之间的相互影响，并确定最佳发酵的值。Zhang等[29]确定芽胞杆菌Z-14最佳发酵培养基为：1.17%玉米粉，3.31%酵母，0.072% MnSO4·H2O，0.2% NaH2PO4·2H2O，0.4% Na2HPO4·2H2O。在最佳条件下发酵后，孢子产量达到1.85×109CFU/mL。

发酵过程中，菌株需要从环境中吸收碳源、氮源、无机盐等一系列营养成分，而培养基成分的组成和配比对菌体生长发育、活性物质产量、质量和种类影响巨大。Suberu等[30]探究6种氮源、碳源对蜡状芽胞杆菌ABBA1、枯草芽胞杆菌RD7和NRD9产生蛋白酶的影响，其中麦芽糖和牛肉膏对这三株生防菌的蛋白酶产生影响最大。Cheba等[31]在氮源对芽胞杆菌产生几丁质酶的研究中，通过对8中不同氮源的探究，发现0.5%的酵母提取物可大幅度提升几丁质酶的产量。本试验筛选出山梨糖、黄豆粉、花生饼粉3个效果较好的因素，通过响应面法确定其最优配比为：山梨糖0.98 g/L，黄豆粉1.06 g/L，花生饼粉2.08 g/L，其对J2s的校正死亡率可达到65.89%。

改变培养条件影响生防菌的生长速率及其活性物质的产量，Wang等[32]研究发现影响芽胞杆菌产生二乙酰最主要的培养条件是通气速率，其次是转速和温度，二乙酰的最佳发酵条件为在37 ℃、0.6 vvm的条件下充气，转速为200 r/min。在此条件下，二乙酰的效价为7.12 g/ L。Ahmad等[33]将枯草芽胞杆菌分离菌株B4进行分批发酵，发现在发酵11 h时的生物量最大，为4.53 g/L。本研究发现pH、装液量、温度对共培养菌株发酵液的杀线虫活性具有显著性影响在温度30.4 ℃；初始pH 6.49，装液量103.15 mL时其对J2s的校正死亡率可达到58.15%。

本试验发现优化后的发酵培养基成分以及培养条件能够显著提高共培养菌株发酵液对南方根结线虫的毒杀活性，但尚需进一步分离纯化共培养菌株发酵液中主要的杀线虫活性物质并探究其对根结线虫病害的生防机制，为生产中利用共培养生防菌发酵液防治根结线虫病奠定坚实的研究基础。