影响棉花组织培养及植株再生的主要因素*

高颖慧, 包 颖

(曲阜师范大学生命科学学院,273165,山东省曲阜市)

0 引 言

棉花(Gossypiumspp.)隶属锦葵科(Malvaceae)、棉属(GossypiumL.),是集多功能为一体的重要经济作物.栽培棉花通常包括4个种：亚洲棉(G.arboretumL.)、草棉(G.herbaceumL.)、陆地棉(G.hirsutumL.)和海岛棉(G.barbadenseL.).它们能够提供天然纤维,在纺织业中占据举足轻重的地位；其副产品经加工后,还可以开发出满足人类消费需求的多种产品[1].然而,作为国民经济发展的重要支柱,棉花产业一直受限于棉花欠佳的纤维品质、欠高的单位产量以及欠强的病虫害防御能力等而发展迟缓.利用转基因技术,快速培育高性能棉花品种,已经成为今后的发展方向.遗传转化胚性愈伤组织,是植物转基因育种的主要途径[2-3],但是,由于棉花的基因型多样、植物木质化程度高、外植体敏感度差异大以及代谢物的成分与含量高等多种因素的影响,棉花与其他作物相比,组织培养非常困难[4].本文回顾并探讨了影响棉花组织培养与植株再生的主要因素,分析了棉花组织培养中的常见问题,并对未来棉花快速组织扩繁的研究与发展予以展望.

1 影响棉花组织培养及植株再生的主要因素

棉花组织培养及植株再生受到一系列因素的影响,其中最重要的包括6个方面,即基因型、外植体类型、培养基组成、植物激素、光照和金属离子等.

1.1 基因型

基因型是棉花组织培养工作中的重要限制因素,常涉及多个基因,遗传调控过程复杂[4].在现已建立的棉花再生体系中,大多数品种含有珂字棉或岱字棉血统[5].珂字棉的胚胎发生能力非常强,但其农艺性状并不适合现代农业的发展,所以珂字棉常常被用作研究棉花遗传特征、生理指标、细胞学分析等工作的模式品种[6].

早期的研究表明,基因型的差异对棉花愈伤组织的诱导影响不大.例如,有研究显示[7],利用不同培养基对62个棉花品种下胚轴进行诱导,30天后均能诱导出愈伤组织.然而,该研究也发现,不同基因型在不同培养基上产出的愈伤、形态、颜色都出现了很大的差异.其中具有强胚胎发生能力的品种,会形成质地均匀、疏松且呈现淡黄色或黄绿色的愈伤组织；而具有弱胚胎发生能力的品种,则会产生质地紧密、坚硬且呈现白或绿色的块状愈伤组织.

在体细胞胚胎发生能力方面,棉花不同基因型间存在着较大的差异.多位研究者对不同基因型棉花的胚胎发生能力进行比较时发现,无论是物种间还是物内品种间,棉花体胚发生的能力均表现出不同的特点(表1)[8-12].

表1 棉花胚胎再生能力的分类

吴家和等[13]发现,不同基因型种子的再生能力是制约体胚再生率和转化率的主要因素.目前对棉花进行的分子育种与遗传改良的工作,在很大程度上依赖于体细胞植株再生过程.所以,选育出再生能力强、农艺性状优的基因型,将成为研究者们今后努力的方向.

1.2 外植体类型

体细胞培养是棉花组培中最常用的方式.建立该体系的关键因素之一便是外植体的选择.不同的外植体,如胚珠、胚轴、叶片、叶柄、根、子叶、茎尖等,其出愈率、胚性愈伤转化率都存在着较大的差别.关于诱导棉花愈伤组织的例子最早来自Baesley的报道[14].该学者发现,培养在MS培养基上的胚珠,可以从珠孔处形成愈伤组织.但遗憾的是,这些愈伤组织在继代培养后生长效果变差,没有进行下去.之后,有学者利用陆地棉Coker 310的子叶诱导愈伤组织并最终获得了再生植株[15].接下来,随着棉花组培工作的陆续开展[16-18],研究者们发现,在诸多的外植体中,下胚轴的诱导能力最强,子叶次之；但是当适当控制不同的激素使用和配合其他条件,其他外植体的诱导效率也会升高[16-18].例如：刘桂云通过对激素与温光条件的调控,获得了以戴维逊氏棉叶片为外植体的典型胚状体[17].张朝军等通过调配生长激素,成功利用棉花(CCRI 24)叶柄进行了初生愈伤组织的诱导[18].

1.3 培养基组成

长期以来,琼脂(Agar)一直是棉花组织培养研究中最常用的凝固剂.但是,Thomas等[19]研究表明,吉兰糖胶(Gelrite)可以在一定程度上替代琼脂,并产生更多的愈伤组织.郑泗军等发现,当使用吉兰糖胶作凝固剂时,棉花(河南79)胚性愈伤组织的比例大幅度增加[20].随后的研究发现[21],植物凝胶具有含杂质少、透气性高、透明度好、凝固点低,以及不需要二价阳离子等特性,因此较其他凝固剂更具优势；相对于琼脂、吉兰糖胶,在植物凝胶(Phytagel)作为固化剂的培养基上,陆地棉体胚萌发率与再生率、再生植株的正常出苗率均得到显著提高[21].

除了凝固剂,组织基中还需要添加一些必要的营养、激素、离子等物质.培养基组成在诱导的不同阶段、不同基因型的相同阶段,均存在较大差异(表2),因此是影响棉花组织培养的重要外部因素.通常情况下,在棉花组织培养中,MS培养基是基础培养基,其他各类培养基多是在此培养基的基础上改良或扩展而来.

表2 不同品种棉花再生体系中的培养基组分

1.4 植物激素

在棉花组培与植株再生过程中,植物激素的种类与浓度是重要的调控因素,也是最复杂的因素,与植物的胚胎发生存在着密切的联系.植物常见的内源激素包括吲哚-3-乙酸(Indole-3-acetic Acid,IAA)、激动素(Kinetin,KT)、脱落酸(Abscisic acid,ABA)、赤霉素(Gibberellin,GA)和乙烯(Ethylene,ETH)等.此外,人们在生产实践中,还合成了诸多植物生长调节剂,如2,4-D-二氯苯氧乙酸钠(2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid,2,4-D).这些激素在特定棉花品种的组织培养中,均能起到不同程度的促进作用(表2).

2,4-D是人工合成的生长素类似物,常被作为植物生长调节剂,用于植物组织培养[26-30].不同生长素类物质对照使用试验表明,2,4-D对于促进外植体形成愈伤组织的作用效果最为明显[26].Price和Smith[26]也证明,2,4-D是外植体脱分化和提高出愈率的最有效的植物生长调节剂.同时,在胚状体发育和成熟阶段,低浓度的2,4-D可以提升胚状体的诱导率[27].但是有研究证明,较长时间的2,4-D处理,会明显抑制胚性愈伤组织中的体细胞胚发生受体激酶基因GhSERK2的转录水平,并通过影响内源激素平衡,对胚性愈伤组织的生长产生不利影响[28].在棉花组织培养中,2,4-D多与其他激素配合使用,很少单独使用[29,30].

ABA,因能促进叶脱落而得名.在棉花组织培养中,ABA能调控体胚的发生.有研究表明,ABA可以通过诱导LEC1(LEAFYCOTYLEDON1)、LEC2(LEAFYCOTYLEDON2)、FUS3(FUSARIUM3)和WUSCHEL等基因的表达,调控ABA和GA的动态平衡,促进棉花(CCRI 24)体胚的产生及成熟[31].

反式-玉米素(trans-Zeatin,ZT)是一种从玉米中分离出来的天然激素,作用效果类似于KT,能够促进细胞分裂.单独使用ZT即可直接诱导获得棉花(CCRI 12)胚状体[32].在ZT与其他激素的互作方面[32],IAA的添加能够削弱ZT的诱导效果；2,4-D的添加虽然有利于愈伤组织的形成,却不利于直接诱导出胚性愈伤组织.

除以上这些研究较多的激素外,其他激素有时也被引入棉花的组织培养之中(表2).如芸苔素内酯(Brassinolide,BR),它是一种天然的甾体化合物,可以作为广谱的植物生长调节剂.有研究者发现仅使用0.01 ppm的BR,就能从陆地棉Coker 201和Coker 312两个品种的外植体中获得有效保持活力和胚性的愈伤组织[30].

由此可见,激素或添加物的种类与浓度、外植体的选择等,均会对不同品种棉花的组织培养产生重要影响(表3).

表3 激素或添加物对棉花组培的作用效果

1.5 光照

光照是植物生长过程中的主要能量来源,同时又是一个复杂的环境因素.在植物组织培养中,光照对培养材料的增殖与分化有着重要的影响.

光周期途径,是植物生态学中研究的较为深入的植物开花调控途径[35].在植物组织培养中,合适的光周期能够使外植体材料保持良好的生理状态,从而影响愈伤组织的形成、胚性愈伤转化等过程[36,37].

光质是棉花组织培养中的重要物理因素,不同波长的光能够激活植物相应的信号传导通路,使植物通过光质感受外界变化,进而调节自身的生长发育[38].单色光可调节植物次生代谢产物的含量,从而提高植物的存活率[39].

在一般的棉花组培工作中,白光的应用最普遍.而近期研究发现[40],红光条件处理的外植体,分化时间更短,产生的愈伤组织质量更高,表现为：黄褐色、体积适中,鲜重更高.究其原因,可能与棉花体胚基因AGL15、LEC2、WUS在红光条件下表达量上调促进愈伤组织产生胚性有关[41].另外,红光可以促进植物生长素的合成及其转运,一定强度的红光有益于内源生长素的合成,进而有利于植物的生长发育[41-43].研究者通过进一步的尝试与探究,发现,在棉花(CCRI 12、CCRI 24)组培中,可以综合使用白光和红光,即先利用白光诱导初级体细胞胚,然后再利用红光诱导胚性愈伤组织[44].

蓝光可以影响植物的向光性、促进下胚轴伸长、调节气孔开放、催化相关酶的合成与控制叶绿体运动等,是影响植物发育与生长的另一重要光质[45,46].然而单纯地使用某种单色光并不能满足植物生长发育的要求[47].在棉花组培方面,以CCRI 12下胚轴为外植体,魏喜等通过探究不同红蓝配比的光质对棉花组培的影响,最终发现蓝∶红=1∶3的光质组合利于胚状体的诱导[48].

1.6 金属离子

在植物的组织培养中,除选择适宜的植物激素外,合理地调配金属离子的种类与浓度,也是促进植物愈伤组织形成、减少褐变与促进植株再生的重要方法.

在棉花(细胞质雄性不育的恢复系 G007)的组织培养中,适宜浓度的Zn2+、Ni2+和Ag+能提高出愈速度,对植株再生过程起到积极作用,而加入Co2+后,作用效果与此相反[49].然而,单独使用某种金属离子往往不能满足植物快繁的需要.有研究者发现5 μmol/L的Zn2+和5 μmol/L的 Ni2+的组合不仅能抑制棉花外植体的褐变,而且能正向协调愈伤诱导和胚胎发生[49].

2 棉花组织培养中存在的问题及展望

2.1 存在的问题、可能的成因和解决方法

在棉花组织培养过程中,常见的问题主要为污染、畸形胚和褐变.污染在植物组织培养中属于常规问题,一般情况下,只要做到外植体、培养基、操作环境与培养环境严格无菌,该问题不难解决.因此,相对而言,对于棉花再生体系的构建,最棘手的是畸型胚的出现和褐变问题.

畸形胚出现的原因,一段时间内是学者们探讨的热点.有学者发现,在胚性愈伤组织细胞中,存在着大量的染色体数目和结构的变异,因此认为染色体变异是畸形胚的主要成因之一[50].还有研究证实,随着培养时间的延长,愈伤组织的变异频率有上升趋势,变异类型也更加丰富[51].因此,过长的继代培养时间,也可能是造成畸形出现的重要原因.目前,通过调整外源激素或添加物的种类和浓度,如增加蔗糖(Sucrose)浓度、添加聚乙二醇(Polyethylene Glycol,PEG)以及选取适当种类和浓度的凝固剂等措施,已经能够在一定程度上抑制畸形胚的发生[52].

棉花愈伤组织的褐变问题是制约其再生体系建立的另一难题.褐变现象往往受外界培养条件与植物本身遗传特性的共同影响.师海荣等通过实验比较分析了3个陆地棉品种(713、百棉1号、百棉3号)的褐变愈伤组织中多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase) 的活性和棉酚(Gossypol)含量,发现它们均高于正常的愈伤组织[53],这也印证了在植物生理学上,被大家熟知的有关多酚氧化酶与酚类物质在有氧条件下被氧化为醌类物质,抑制了多种酶的活性,从而影响了愈伤组织的正常生长,甚至导致其死亡的观点[54].有学者利用活性炭(Activated Carbon)的吸附性,吸收组培环境中对植物细胞不利的酚类化合物和过量添加物[55],达到了抑制褐变现象的效果.同时,改变碳源也是应对褐变现象的新思路.如Sunnichan 等[56]使用甘露糖(Aldohexos)作为培养基中的唯一碳源,在从Coker 310外植体诱导为愈伤组织到体胚发生的整个阶段中,都没有出现组织褐变现象.

2.2 展望

随着越来越多作物全基因组测序的完成、诸多基因改造技术如Crispr等的不断完善,作物分子育种和基因革新已经成为新时代农业发展的必然趋势.在此背景下,如何合理地将植物组织培养和分子改良有机结合,将是今后检测基因功能、评价作物性状和构建快繁体系的关键.但是,棉花的组织培养一直是公认的技术难题,尽管陆续有不同的学者在特定的棉花品种上成功培育出了再生体系,但是这些再生体系往往缺少通用性和推广性.此外,以往的研究在有效诱导胚性愈伤、控制畸形胚和褐化现象以及缩短组培周期等方面,还缺少明显的突破,这种现状严重限制了棉花遗传育种的长足发展.因此,进一步阐明外界物理因素与棉花生理功能之间的关系,缩短继代周期、快速提升体胚诱导和植株再生,同时有效控制畸形胚和褐变现象,兼顾不同品种棉花的遗传差异,寻找更为高效、广谱的棉花再生体系,将成为今后研究与发展棉花组织培养的主要方向.