产NDM-1阴沟肠杆菌的耐药性与毒力基因分布

余 艳,牛 敏,杜 艳,任玉吉,代鹏飞,何秋月,刘淑敏

(昆明医科大学第一附属医院检验科 云南省检验医学重点实验室 昆明医科大学第一附属医院临床检验诊断省创新团队，云南 昆明 650032)

新德里金属β-内酰胺酶-1(New Delhi metallo-β-lactamase-1, NDM-1)可水解几乎所有β-内酰胺类抗生素，产NDM-1的细菌引起的感染临床致死率较高[1]。阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae，ECL)是一种重要的条件致病菌，可以产生多种抗生素水解酶，目前研究[1-2]显示产碳青霉烯酶尤其是NDM-1是耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌(carbapenem-resistantEnterobactercloacae, CRECL)的主要耐药机制。

除了产生各种抗生素水解酶以外，ECL也能表达多种毒力因子，包括菌毛、蛋白质分泌系统、毒力岛、脂多糖、铁载体、毒素、外排泵等，这些毒力因子在细菌黏附、入侵宿主、免疫防御、引起宿主损伤的过程中发挥重要作用[3-7]。ECL含有丰富的质粒和染色体基因组，易于获得包含耐药基因和毒力基因的多种可移动遗传元件，二者的遗传机制主要通过基因水平转移而实现[5]，并且相互关联，在细菌的进化过程中发挥重要作用[8]。通常情况下，细菌在获得耐药性后，由于适应性代价的原因，会导致毒力下降[9]。然而，随着菌株突变，耐药菌可通过补偿性进化机制使其毒力和生存能力增强[10]，使得临床感染治疗更加困难。国内外研究[4, 11]表明，携带NDM-1基因会对ECL的致病性产生一定影响，但目前相关研究较少。因此，本研究拟分析携带NDM-1基因ECL的耐药特点、毒力基因携带情况，为进一步研究NDM-1基因对ECL毒力、致病性的影响提供帮助，甚至为研究新颖有效的抗感染疗法、缓解致病菌感染及耐药现状提供新视角。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 收集2017年1月—2020年11月昆明医科大学第一附属医院分离鉴定的ECL，试验组为29株产NDM-1的CRECL，对照组为32株不产NDM-1的CRECL及同期分离的35株碳青霉烯类敏感ECL(CSECL)，剔除同一患者不同部位分离的重复菌株。根据美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)指南，CRECL的判读标准为：亚胺培南或美罗培南 MIC ≥ 4 μg/mL或厄他培南 MIC ≥ 2 μg/mL，根据NDM-1基因检测结果进一步将CRECL分为产NDM-1和不产NDM-1菌株，CSECL菌株对碳青霉烯类药物均表现为敏感。质控菌株大肠埃希菌ATCC 25922和ECL ATCC 700323 均由本实验室保存。

1.1.2 试剂与仪器 VITEK 2全自动微生物鉴定及药敏分析仪(法国梅里埃公司)、基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱仪MALDI-TOF MS(布鲁克科技有限公司)、药敏纸片(英国Oxoid公司)、DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)、DNA Marker(大连宝生物公司)、2×Taq PCR Master Mix、Golden View 核酸染料、50 ×TAE Buffer(北京博迈德基因技术有限公司)、琼脂糖(西班牙Biowest 公司)、引物合成及 DNA 测序(北京擎科生物科技有限公司昆明分公司)、PCR扩增仪(西安天隆科技有限公司)、电泳仪(北京六一生物科技有限公司)、凝胶成像仪(美国GE Healthcare公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌株鉴定与药敏试验 采用VITEK 2 Compact进行菌种鉴定，MALDI-TOF MS复核菌种鉴定结果，全自动药敏系统联合K-B纸片法进行药敏试验，替加环素和多粘菌素的药敏试验采用微量肉汤稀释法。试验操作及结果判识参照CLSI M100(第28版)标准[12]。

1.2.2 NDM-1耐药基因与毒力基因检测 提取分离菌株DNA作为PCR扩增模板。采用PCR方法对61株CRECL进行NDM-1耐药基因扩增，引物序列及反应条件参照文献[13]进行。对所有96株ECL菌株进行24种毒力基因包括耶尔森毒力岛基因(irp-2、fyuA)、铁载体基因(fhuA、sodB、sltA)、Ⅲ型分泌系统(T3SS)编码基因(escV、nleB)、Ⅴ型分泌系统(T5SS)编码基因(pic、pet)、Ⅵ型分泌系统(T6SS)编码基因(clpB、icmf、VasD/Lip)、脂多糖基因(WaaL、WaaG)、Ⅰ型菌毛基因(fimH)、Ⅲ型菌毛基因(mrkD)、生物膜胞外多糖基因(wcaA、wcaM、wza)、外排泵基因(acrA、tolC)、志贺肠毒素基因(shET1)、细胞毒性坏死因子基因(cnf1)、溶血素基因(hlyA)，引物序列、反应条件、产物大小参照相关文献[3-7, 14]。PCR产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳(120 V×30 min)后，在凝胶成像系统中进行观察。扩增阳性产物送测序并将测序结果与Genbank数据库中相应序列比对验证。

1.2.3 统计学方法 应用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计数资料以例数或百分比表示，采用卡方检验(Chi-square test)比较组间分布差异，P≤0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NDM-1耐药基因检出率 2017年1月—2020年11月共收集61株CRECL，经PCR扩增测序比对，有29株检出NDM-1基因，检出率为47.5%。图1为部分菌株NDM-1基因电泳图。

M：DNA Marker(DL 2000)；1～8：NDM-1基因阳性菌株；9：阳性对照；10：阴性对照。

图2 29株产NDM-1的CRECL对常用抗菌药物耐药率

2.3 毒力基因 96株ECL菌株中，外排泵和生物膜胞外多糖编码基因acrA、tolC、wcaA、wcaM、wza的检出率较高，分别为80.2%、90.6%、87.5%、75.0%、92.7%, T6SS编码基因clpB、icmf、VasD/Lip的检出率也均在60%以上，未检出escV、nleB、pet、hlyA等毒力基因。

2.3.1 产NDM-1的CRECL和不产NDM-1的CRECL毒力基因分布差异 产NDM-1酶 CRECL组检出率最高的是acrA基因(96.6%)，不产NDM-1酶CRECL菌株检出率最高的是wza基因(90.6%)，产NDM-1的CRECL菌株clpB、icmf、VasD/Lip、acrA检出率高于不产NDM-1的CRECL，而不产NDM-1的CRECL组wcaM基因检出率高于产NDM-1的CRECL组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 产NDM-1和不产NDM-1的CRECL毒力基因检出情况[株(%)]

2.3.2 CRECL和CSECL毒力基因分布差异 CRECL和CSECL菌株中检出率最高的都是wza基因，分别为91.8%和94.3%。CRECL组clpB、icmf、VasD/Lip基因检出率高于CSECL，差异具有统计学意义(均P<0.05)，其余毒力基因的检出率不具有统计学差异(均P>0.05)。见表2。

表2 CRECL和CSECL两组菌株的毒力基因检出情况[株(%)]

3 讨论

ECL是一种重要的革兰阴性杆菌，可引起多种感染。据报道[15]，由其引起的医疗保健相关感染在所有肠杆菌目细菌中排名第三。随着碳青霉烯类药物的广泛应用，全球各地相继出现CRECL播散流行，全国细菌耐药监测网结果显示，2015—2019年ECL对碳青霉烯类抗生素的耐药率为3.4%～7.0%[16]，多项研究显示NDM-1酶是CRECL中最常见的碳青霉烯酶，检出率为53%～72%，并且多地都出现过产NDM-1的ECL暴发流行[1-2，15，17]。本研究收集了61株CRECL，NDM-1基因检出率为47.5%(29/61)，比同类报道的检出率稍低,说明NDM-1基因检出率存在地区差异，也比前期课题组的检出率(80%)低[13]，提示本地区产NDM-1的ECL流行病学特征可能发生了重要变迁，为临床防控提供了重要的流行病学依据。药敏结果显示29株产NDM-1的CRECL均为多重耐药，与类似报道一致[18]。阿米卡星是氨基糖苷类抗生素，其耐药率较低，主要是由于肾毒性、耳毒性等副作用，使用一直受到限制。大部分菌株对氨基糖苷类、喹诺酮类抗生素表现出较高的敏感性，因此可根据药敏结果选择性使用一种或两种药物进行抗感染治疗。理论上NDM-1不能水解氨曲南，但本研究中氨曲南的耐药率达44.8%，主要是因为携带NDM-1基因的质粒常同时携带多种耐药基因编码多种抗生素水解酶，也包括能水解氨曲南的ESBLs和/或 AmpC 酶，从而导致氨曲南耐药甚至泛耐药。多粘菌素和替加环素是目前治疗此类细菌感染的主流选择，大部分菌株对其敏感率较高，研究显示使用替加环素、多粘菌素联合其他药物可显著提高患者的临床治疗效果[19]，但由于多粘菌素副作用大、替加环素价格昂贵等多种原因限制了这两种药物的应用和普及，随着对这两种药物耐药菌株的出现，进一步加剧了临床抗感染治疗的难度,甚至可能出现无药可用的境地。再加上目前尚缺乏针对NDM-1的常规标准化表型检测方法以及能有效治疗多重耐药产NDM-1酶细菌的抗生素[20]，且多数携带NDM-1基因的菌株可通过质粒进行广泛克隆播散[21]，如果携带大量毒力基因的移动遗传元件转移到耐药质粒中，就会产生高耐药合并高毒力菌株，给临床感染控制和公共健康带来极大威胁。

毒力是细菌的重要致病因素，在感染中发挥重要作用。国内外研究显示NDM-1基因不仅赋予肠杆菌目细菌高度耐药性，而且还能使肺炎克雷伯菌毒力增强[22]、ECL的繁殖能力与致病性增强[12]，课题组前期研究显示携带NDM-1基因会使ECL体外生长能力增强[23]。目前有研究[24]表明携带NDM-1基因的大肠埃希菌毒力基因携带率较低，但携带NDM-1基因与ECL毒力基因检出率的相关性未见报道，因此本研究分析了产NDM-1和不产NDM-1的CRECL之间以及CRECL和CSECL之间毒力基因的分布差异。

结果显示产NDM-1的CRECL菌株clpB、icmf、VasD/Lip、acrA检出率显著高于不产NDM-1的CRECL(P<0.05)。clpB、icmf、VasD/Lip是T6SS编码基因，与细菌的毒力密切相关。敲除T6SS相关编码基因的鲍曼不动杆菌，其生长速度减慢,对细胞黏附能力降低，对小鼠的致死能力降低[25]。本研究中T6SS在ECL中普遍存在，与Mustafa等[3]报道一致，并且在产NDM-1 ECL中的携带率更高。acrA基因是AcrAB-TolC外排系统的编码基因，可以增加细菌的适应性和毒力[6]，产NDM-1的CRECL菌株中的携带率更高。因此，产NDM-1的ECL不仅耐药性强，而且某些毒力基因的携带率更高，可能会导致其毒力增强，但毒力基因的携带率与其在体内致病性强弱的关系需要进一步试验验证。另外，Guérin等[26]研究表明ECL复合体中AcrAB-TolC 外排泵缺失会导致菌株毒力减弱，而生物被膜的产量却增加。生物膜的结构组成、功能行使均与胞外多糖密切相关[27]，wcaM基因是ECL生物膜胞外多糖合成基因。本次试验结果表明产NDM-1的CRECL组acrA基因检出率显著增高而wcaM基因检出率则显著降低，但对于产NDM-1的CRECL菌株外排泵与生物膜的关系还需要更多试验验证。

目前对耐碳青霉烯类肠杆菌的毒力研究主要集中在肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌，大量研究报道耐碳青霉烯类高毒力肺炎克雷伯菌株给临床治疗带来了极大困扰，其重要分子特征是同时携带碳青霉烯耐药质粒及毒力质粒[28]，也有研究显示耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的毒力显著增强[29]，Gomez-Simmonds等[30]研究表明CRECL增强了耐药基因的传播能力，但并没有提高毒力。本研究结果显示T6SS编码基因clpB、icmf、VasD/Lip在CRECL中的检出率显著高于CSECL菌株，差异具有统计学意义(均P<0.05)，表明T6SS作为毒力因子，在ECL中普遍存在并且与耐药性存在一定关联，CRECL往往合并T6SS的高检出率。

综上所述，携带NDM-1基因ECL伴随clpB、icmf、VasD/Lip、acrA毒力基因的高检出率，从而可能导致其毒力发生改变，但本研究收集的菌株样本量有限，仅从基因水平进行分析，若要探讨NDM-1基因对ECL毒力的影响，除了扩大样本量以外，可能还需要结合临床感染特征，进行细胞、动物试验进一步论证。由于耐药菌的不断突变及全球传播，侧重于对抗病原菌毒力因子的抗毒力治疗已经成为一种新的治疗策略[31],本文也可为研究新颖抗感染疗法提供一些新视角。总之，为防止高耐药合并高毒力菌株的出现，除了积极开发抗菌药物以外，医疗机构还要对产NDM-1的ECL进行流行病学监测、早期发现多重耐药高危菌株，及时采取感染控制措施，防止其暴发流行。