蒲首丞,胡美娟,陈梦露,郑 治,尹新忠
(1. 浙江华仕达茶业股份有限公司,浙江 武义 321200;2. 浙江华茗园茶业有限公司,浙江 永康 321300;3. 浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江金华 321000;4. 浙江省永康市食品与药品检测中心,浙江永康 321300)
近年来,抹茶作为一种健康天然饮品,受到人们的欢迎,由于覆盖栽培及特殊加工方法,抹茶极大地保持了绿茶鲜叶原有的天然色泽及营养保健功效成分。抹茶保留了茶叶中的100 多种成分,主要为茶多糖、茶多酚、咖啡碱、游离氨基酸、叶绿素、蛋白质、芳香物质、纤维素,还有大量的维生素和矿物质,其中茶氨酸和叶绿素含量都比较高,这些生物活性成分使得抹茶具有改善血液流动、改善心血管疾病、缓解压力、安眠功效、降血脂、降血糖等作用[1-2]。茶氨酸和茶多酚是抹茶主要成分,茶氨酸(N - 乙基γ - 谷氨酰胺) 是一种酰胺类化合物,天然存在的茶氨酸均为L 型,是茶叶中特有非蛋白类氨基酸,具有稳定的化学性质及非常高水溶性,占茶叶中游离茶氨酸的一半作用,可以减弱茶的苦涩味,增加茶鲜美的味道,可作为一种食品添加剂使用[2-4]。许多科学研究表明,茶氨酸具有增强人体免疫力、降低血压、抑制癌细胞生长、保护神经细胞、抑制神经元的凋亡、松弛神经紧张、安神作用等作用[4-7]。目前,关于茶多酚研究比较多,特别是儿茶素类活性成分,具有抗氧化、抗肿瘤、抗氧化、抗糖尿病、抗高血压等作用[8]。
基于UPLC-MS 测定抹茶中主要6 种特征性成分,主要包括茶氨酸和儿茶素类成分,分析2020 年春茶同一茶园不同时间段抹茶主要成分变化,通过聚类分析不同时间段的样品,以期为抹茶质量控制提供参考。
1.1.1 原料
抹茶,2020 年春茶(鸠坑)。
1.1.2 试剂
乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯;水;标准品:茶氨酸(L-The)、儿茶素(C)、表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG),上海安谱试验科技股份有限公司提供;咖啡碱(CAF),中国计量科学研究院提供。
1.1.3 仪器设备
JYL-C020E 型多功能料理机,九阳股份有限公司产品;FA2004 型电子天平,上海舜宇恒平科学仪器有限公司产品;TG16-WS 型台式高速离心机,湖南湘仪实验仪器开发有限公司产品;HH-600 型数显恒温循环水箱,常州智博瑞仪器制造有限公司产品;1290 Infinity 型超高效液相色谱仪、色谱柱(ZORBAX Eclipse Plus C18型,2.1 mm×100 mm,1.8 μm)、保护柱(ZORBAX Eclipse Plus C18型,2.1mm×50 mm,1.8μm),安捷伦公司产品;4500 型三重四极杆质谱TRIPLE QUAD 4500,AB Sciex 公司产品。
1.2.1 标准品制备
标液:精确称取标准物质各10.0 mg,分别用70%甲醇水溶解后定容至10 mL 棕色容量瓶中,得质量浓度为1 000 μg/mL 储备母液,不同质量浓度混合标准品溶液用储备母液稀释配制。
混和标准品溶液见表1。
表1 混和标准品溶液
1.2.2 供试品制备
供试液:称取0.2 g 样品,加入在70 ℃预热过的70%甲醇溶液50 mL,混于100 mL 锥形瓶中,于70 ℃水浴中浸提20 min(5 min 搅拌1 次),冷却后转移到100 mL 容量瓶中,用70%甲醇水定容至刻度,摇匀。移液管移取1 mL 上清液于100 mL 容量瓶中,用70%甲醇水定容至刻度,摇匀,过0.22 μm滤膜,待测。
1.2.3 UPLC- MS 分析条件
(1) 色谱条件。流动相:乙腈(流动相A)、0.1%甲酸水溶液(流动相B),流速0.2 mL/min,进样量1 μL,柱温40 ℃,运行时间15 min。
流动相梯度见表2。
表2 流动相梯度
(2) 质谱条件。离子源:电喷雾离子源(ESI),扫描模式:正离子模式,扫描方式:多反应离子监测(MRM),离子化电压5 500 V,加热温度450 ℃,喷雾气GS1 50 psi,辅助加热气GS2 50 psi,碰撞气CAD 8,气帘气CUR35 psi,MRM离子对信息。
MRM离子对信息见表3。
表3 MRM 离子对信息
1.2.4 方法学考查
(1) 线性关系考查。精密吸取不同质量浓度混合标准照品溶液分析,1 μL 进样,测其峰面积,以标准溶液的进样含量为横坐标,以峰面积为纵坐标作图,得到线性回归方程,求相关系数R。
(2) 精密度试验。精密吸取配制的对照品溶液1 μL 进样,依上述色谱条件测定,重复进样6 次,测定计算目标峰面积,计算RSD 值。
(3) 稳定性试验。取制备的供试样品溶液,于0,2,4,6,8,10 h 进样测定,按1.2.3 色谱分析条件,进样量为1 μL,测定目标峰面积,计算RSD 值。
(4) 重复性试验。取样品按1.2.2 方法制备供试品溶液6 份,按1.2.3 色谱分析条件,进样量为1 μL,测定峰面积,计算RSD 值。
(5) 加样回收试验。精密称取已知含量的茶样品3 份,分别精密加入一定量高中低对照品,按
1.2.2 供试品溶液制备方法制备样品溶液,依上述色谱条件测定含量。
1.2.5 样品含量测定
取不同时间段采集生产加工抹茶,以1.2.2 进行前处理,在按1.2.3 色谱分析条件进行测定,检测不同抹茶样品中的茶氨酸、儿茶素类和咖啡因含量。
1.2.6 聚类分析
以6 批样品的7 个主要特征成分含量为指标,运用SPSS19 统计分析软件,进行聚类分析。
2.1.1 线性关系考查
混合标准品UPLC-MS 色谱图见图1,线性回归方程和相关系数见表4。
图1 混合标准品UPLC-MS 色谱图
表4 线性回归方程和相关系数
图1 为混合标准品UPLC-MS 色谱图,表4 中是L-The,EGC,C,CAF,EC,EGCG 和ECG 的色谱保留时间标准曲线回归方程、相关系数和线性范围。结果表明,抹茶中7 种化合物灵敏度较高,在给定的质量浓度范围内线性关系良好。
2.1.2 精密度试验
精密度、稳定性和重复性试验相对标准偏差RSD 值见表5。
表5 精密度、稳定性和重复性试验相对标准偏差RSD 值/%
表5 中是L-The,EGC,C,CAF,EC,EGCG和ECG 的精密度试验RSD 值,分别为2.83%,4.42%,1.67%,2.03%,0.92%,3.66%和1.96%,结果表明试验仪器要具有较好的精密度。
2.1.3 稳定性试验
取制备的供试样品溶液于0,2,4,6,8,10 h进样测定,表5 中是L-The,EGC,C,CAF,EC,EGCG 和ECG 的稳定性试验RSD 值,分别为5.74%,3.75%,4.36%,3.09%,2.58%,7.44%和3.39%,供试品溶液中EGCG 的稳定性没有其他成分高。
2.1.4 重复性试验
表5 中是L-The,EGC,C,CAF,EC,EGCG和ECG 的供试品重复性试验RSD 值,分别为1.91%,2.24%,4.16%,6.55%,1.51%,1.98%和1.34%,表明茶样具有较好重复性。
2.1.5 加标样回收试验
添加1 mL 选择已知质量分数的样品作为本底样品,在本底样品中准确加入低、中、高3 个质量浓度的混标,然后进行分析。
7 种多酚物质的加标样回收率分析见表6。
表6 7 种多酚物质的加标样回收率分析
样品含量分析见表7。
表7 样品含量分析/ mg·g-1
采用该方法测定的浙江武义同一个茶园不同时期生产抹茶样品7 种特征化合物,其中茶氨酸变化最明显,下降最多,儿茶素类呈现缓慢降低,具体结果见表7。前3 d,茶叶中茶氨酸的含量较高为24 mg/g,在5 d 后茶氨酸含量降低50%左右,为13 mg/g,与感官审评结果相符合,前3 d 抹茶滋味清鲜、略带海苔味,后几天茶样微涩,也与其他科研人员关于茶氨酸对抹茶品质呈正相关的研究一致[9]。
以抹茶主要特征成分L-The,EGC,C,CAF,EC,EGCG 和ECG 为指标,采用组间联接法、平方Euclidean 距离度量标准进行系统聚类分析。
聚类分析见图2。
图2 聚类分析
当距离大于15 时,样品可分为2 类,其中day1和day3 抹茶为一类,day5,day7,day9 和day11 聚为一类;当距离在10 左右时,可将6 个时间短样本很好的分为3 类,其中day1 和day3 抹茶仍为一类,day5,day7,day9 聚为一类;day11 单独聚为一类。由此可见,不同生长时间段抹茶的主要特征生化成分随时间在不停变化,其中茶氨酸变化最大,通过统计聚类分析可以很好地区分不同时间段抹茶,对抹茶等级划分具有较好指导意义。
建立了UPLC-MS 同时测定抹茶中7 特征性化合物的分析方法,具有灵敏度高、准确稳定、方便快捷等特点,适合于茶叶中茶氨酸儿茶素和咖啡碱类化合物的快速测定。