酶比色法和雷氏盐分光光度法在测定特殊医学用途配方食品中胆碱含量的比较

梁喜玲

（陕西省产品质量监督检验研究院，陕西西安 710048）

0 引言

胆碱（Choline），又名胆素，是一种含氮的有机碱性化合物，1849 年首次从猪肝中被分离出来，化学名称为β - 羟乙基- 三甲胺，分子式为C5H15NO2。在维持正常的人体机能方面胆碱及其衍生物有着极其重要的作用[1]。通常情况下在生物有机体内以游离态胆碱、乙酰胆碱、卵磷脂或鞘磷脂等形式存在，一旦缺乏可能会引起干细胞受损、肾脏损害、记忆力损伤及引起心脑血管等一系列疾病[2-3]。目前，对于人体缺乏胆碱所受影响的相关研究较多, 虽然人体缺乏胆碱会带来相关疾病，但摄入量只需满足机体需求即可, 无需过量摄入。胆碱及其衍生物是一种重要的营养物质，人体在肝脏中可以合成胆碱，但人体自然合成的胆碱不足以满足人类的正常需要，因此从食物中摄取大部分胆碱是很有必要的[4]。人类必须从饮食中获得一定量的胆碱，尤其是一些特殊人群，如孕产妇，除正常的饮食摄取外，可适当补充一些添加了胆碱的特殊营养物质。作为营养强化剂，胆碱的主要化合物来源有氯化胆碱和酒石酸氢胆碱2种形式。

以特殊医学用途配方食品中胆碱的测定为例，对酶比色法和雷氏盐分光光度法[5]进行比较，研究建立快速准确的胆碱类物质检测方法，对于一些特殊医学用途的配方食品具有重要意义，同时对食品检测人员更好地开展胆碱检测工作提供参考。

1 试剂与仪器

1.1 样本与试剂

2 个批次的孕产妇营养配方谷粉，样本由企业提供；质控样，中国检验检疫科学研究院测试评价中心提供。

胆碱酒石酸氢盐标准品；磷脂酶D、胆碱氧化酶和过氧化物酶，美国Sigma 公司提供，酶的保存需要注意其保存条件；酶比色法和雷氏盐分光光度法中的其他常规试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司提供。常规试剂的配制完全依照GB 5413.20—2013《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定》中的方法进行。

1.2 仪器与设备

层析柱、250 mL 磨口锥形瓶及回流装置、电热恒温水浴锅、ATL-224 型电子天平、T9CS 型紫外-可见分光光度计等。

1.3 试验方法

1.3.1 样本的前处理

2 种测定方法中样本的前处理过程完全参照国标GB 5413.20—2013《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定》中的方法进行。

1.3.2 标准溶液配制

酶比色法中的胆碱氢氧化物标准储备液（质量浓度2.5 mg/mL）、胆碱氢氧化物标准工作液（质量浓度250 μg/mL）、雷氏盐分光广度法中的胆碱酒石酸氢盐标准溶液（1 g/L） 的配制均参照国标方法进行。胆碱酒石酸氢盐标准溶液需保存在4±2 ℃冰箱中，且勿超过1 周。

1.3.3 发色剂配制

取苯酚50 mg、4 - 氨基安替比林15 mg、胆碱氧化酶（100～120 活力单位） 10～15 mg、过氧化物酶（250～280 活力单位） 1.95～2.35 mg 和磷脂酶D（75～100 个活力单位） 1.80～ 2.00 mg 放置于100 mL的容量瓶中，用Tris 缓冲溶液（0.05 mol/L） 稀释到刻度线，现用现配。

1.4 精密度试验

选择样本1 孕产妇营养配方谷粉作为精密度测试的研究对象。分别称取1 号样本12 份，在相同的试验条件下，用酶比色法平行测定6 份产品中的胆碱含量，另外6 份用雷氏盐分光广度法测其胆碱含量，研究2 种方法的精密度情况。

1.5 数据处理

采用常用软件Excel 软件进行数据分析处理。

2 步骤分析

2.1 标准曲线的绘制

2.1.1 酶比色法标准曲线的绘制

准备6 支试管，分别做好标记，管A 作为试剂空白管，其余5 支由1～5 编号备用。按照GB 5413.20—2013 中的方法，分别移取一定体积的胆碱标准工作溶液（2，4，6，8 mL） 用蒸馏水定容于10 mL容量瓶。参照表1 中的试剂添加量，加入不同梯度的试剂，然后按照GB 5413.20—2013 中的方法进行处理。加入发色剂后，盖塞密封、混匀，然后将所有试管放置于37 ℃的恒温水浴中保温反应15 min。

标准曲线制备时的试剂添加量见表1。

表1 标准曲线制备时的试剂添加量

参照国家标准GB 5413.20—2013 中胆碱的测定方法，将标准系列溶液用紫外分光光度计进行测定，标准曲线的横坐标为胆碱标准溶液的质量浓度（μg/mL），纵坐标为相应的吸光度，绘制标准曲线，所拟合的标准曲线线性方程为Y=0.003 0X+0.021 8，R2=0.999 5，线性良好。

酶比色法标准曲线见图1。

图1 酶比色法标准曲线图

2.1.2 雷氏盐分光光广度法标准曲线的绘制

将层析柱与滴头用乳胶管连接，层析柱的底部用脱脂棉堵住，添加大约5 cm 高的弗罗里硅土，用甲醇提前浸湿，备用。分别移取一定体积胆碱标准溶液（0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL） 于层析柱中，待标准溶液完全进入层析柱后，依次用5 mL 和10 mL甲醇，20 mL 乙酸甲酯洗涤，再加入雷纳克铵盐溶液5 mL，过量的雷纳克铵盐用适量的冰乙酸洗涤除去，直至层析柱呈现硅土原有的白色。粉红色的胆碱雷纳克铵盐用丙酮洗脱，用10 mL 的容量瓶收集并定容，若洗脱液混浊则需用0.45 μm 的滤膜过滤，备用。选定波长526 nm 测定滤液的吸光度，标准曲线的横坐标为胆碱酒石酸氢盐含量（mg），纵坐标为相应吸光度，绘制标准曲线图，所拟合的标准曲线线性方程为Y=0.038 9X+0.001 1，R2=0.999 2，线性较好。

雷氏盐分光光度法标准曲线见图2。

图2 雷氏盐分光光度法标准曲线图

2.2 试样的测定

样本的测定中，酶比色法按照表2 所示的试剂添加量进行试验，每个试样分别准备（B、C） 2 支试管。在做标准系列溶液的同时，样本也参照方法同时进行。

样本测定时的试剂添加量见表2。

表2 样本测定时的试剂添加量

雷氏盐分光光度法中移取10 mL 试样水解液于层析柱中，其余方法均同于2.1.2 中的方法进行。

3 结果与分析

3.1 测定结果

在相同的条件下，将质控样和2 个批次的孕产妇营养配方谷粉总计3 个样本分别用酶比色法和雷氏盐分光光度法进行测定，2 种方法测定的样本和质控样的胆碱含量差值均较小。对质控样的胆碱含量测定后，与其理论值117.5 mg/100 g 进行比对，对试验结果的可靠性进行验证。

2 种方法检测质控样与2 个样本的胆碱结果见表3。

表3 2 种方法检测质控样与2 个样本的胆碱结果

3.2 精密度试验结果

用酶比色法对1 号样本平行测定6 次，胆碱含量的平均值为156.2 mg/100 g，相对标准偏差（RSD）为1.41%；用雷氏盐分光广度法测定6 次平行试验的结果为154.6 mg/100 g，相对标准偏差（RSD）为2.42%，表明2 种胆碱测定方法的精密度较好，且2 种方法测定结果相差不大，可以满足检测要求。

1 号样本精密度试验结果见表4。

表4 1 号样本精密度试验结果

4 结论

在已探究酶比色法测定特殊医学用途配方食品中胆碱含量方法适用性基础上，通过对样本与质控样中胆碱含量的测定发现，酶比色法和雷氏盐分光光度法的测试结果较为相近，标准曲线的拟合与精密度试验均能满足检测的要求。酶比色法的专属性较强且重复性较好，操作步骤相对简单容易，但检出限及酶的价格相对较高，考虑到成本消耗其使用面就受到一定程度的限制；而雷氏盐分光光度法则需要用到层析柱，前处理较为繁杂且耗时长、样品易损失，但对设备要求不高，成本相对低廉，故而在工作中应该综合考虑，结合实际情况选择合适的检测方法。