局部应用不同剂量普伐他汀干预兔激素性股骨头坏死的组织学观察*

杨业静 梁红锁 蔡 敏 农桔安 刘 雷 杜勇军

广西南宁市第二人民医院关节外科 530031

研究表明，他汀类药物局部应用于骨内具备骨诱导作用，可促进新骨形成[1-2]。骨形态发生蛋白2(Bone morphogenetic protein-2，BMP-2)因具有显著的诱导骨与软骨形成特性而被广泛应用于骨科基础与临床研究，本课题组前期研究中发现普伐他汀局部应用干预兔激素性股骨头坏死(Steroid-induced osteonecrosis of the femoral head，SONFH)，可以促进坏死股骨头BMP-2高表达，加速骨坏死修复[3-4]。理论上随着局部用药量的增加，药物本身所产生的不良反应可能会增多。本实验旨在观察局部给予不同剂量普伐他汀干预SONFH的效果，探讨其给药的最佳剂量，以期为SONFH治疗提供新的方法。报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 成年健康新西兰兔40只，雌雄不限，体质量2.5～3.0kg，由广西医科大学实验动物中心提供，实验动物使用许可证号：SYXK(桂)2014-0003。所有动物在同一室内分笼饲养，给予定量饲料喂养，自由饮水。室温20～22℃，湿度40%～60%，维持室内自然光照及良好通风。

1.2 动物模型制备与分组 所有动物常规适应性喂养2周，再次称重后制备SONFH模型，参照秦岭等[5]的造模方法：以10μg/kg剂量经兔耳缘静脉注射内毒素(Lippolysaccharide,美国Sigma公司)1次，24h后以20mg/kg剂量的甲强龙(Methylprednisolone,美国辉瑞公司)进行3次臀肌注射，每次间隔24h。造模6周后，采用随机数字表法将动物分为A、B、C、D 4组，每组10只，各组间动物体质量及雌雄构成比无统计学意义(P>0.05)。所有动物在麻醉后进行股骨头髓芯减压术，其中A组于股骨头髓芯减压通道内植入含1mg普伐他汀(钴60辐照灭菌，下同)的明胶海绵，B组植入含2mg普伐他汀的明胶海绵，C组植入含5mg普伐他汀的明胶海绵，D组植入含10mg普伐他汀的明胶海绵。髓芯减压采用本课题组前期实验方法[6]。

1.3 观察指标 分别在股骨头髓芯减压术后第8、12周以空气栓塞法每组各处死5只兔子，取其左侧股骨头标本进行病理学研究，对侧行分子生物学相关研究(另文发表)。剔除股骨头周围软组织，将兔股骨头沿冠状面正中纵行切开进行大体观察，重点观察兔股骨头的外形、颜色、软骨厚度等。随后股骨头标本以10%甲醛溶液固定后，5%硝酸浸泡脱钙，梯度乙醇脱水，常规石蜡包埋后进行切片，厚度为5μm。脱蜡后进行HE染色，光镜下观察软骨、软骨下骨、骨髓腔内骨小梁结构及各种细胞成分如骨细胞、脂肪细胞等变化情况。每个标本光镜下随机选取5个高倍视野，每个视野计数20个骨细胞中的空骨陷窝数量，其平均值即为该股骨头的空骨陷窝率(空骨陷窝数量/20×100%)。

2 结果

2.1 大体观察 A组:髓芯减压术后第8周，股骨头软骨面颜色暗红，骨皮质薄且松脆，易于切开，髓腔内可见大范围骨坏死。术后第12周，股骨头外形正常，骨皮质较前稍增厚，骨坏死面积稍减小。B组：术后第8周，股骨头软骨面颜色较暗，骨皮质薄且脆，髓腔内有较多坏死骨组织。术后第12周，股骨头外观正常，骨坏死面积较前减少。C组：术后第8周，股骨头软骨面颜色稍暗，骨皮质稍薄，质硬，有少量坏死骨组织。术后第12周，股骨头外形正常，颜色正常，软骨面光滑、完整。D组：术后第8周，股骨头软骨面颜色稍白，骨皮质略薄，骨质较硬，髓腔内可见有少量坏死组织。术后第12周，股骨头外观及软骨面颜色正常。

2.2 光镜观察 A组：术后第8周，股骨头内可见大量坏死骨组织，骨小梁稀疏、断裂，有较多空骨陷窝，脂肪细胞堆积。术后第12周，股骨头内有部分纤维组织及新生骨小梁形成，空骨陷窝较前稍减少(见图1)。B组：术后第8周，股骨头内有较多坏死骨组织，脂肪细胞数目增多，骨小梁纤细、紊乱，空骨陷窝数较多。术后第12周，股骨头内有少量新生骨小梁形成，空骨陷窝数稍减少(见图2)。C组：术后第8周，股骨头内可见少量脂肪细胞，骨小梁相对致密，排列稍紊乱，空骨陷窝数较少。术后第12周，股骨头内有广泛新生骨小梁形成，空骨陷窝少(见图3)。D组：术后第8周，股骨头内骨小梁较排列较整齐、规则，脂肪细胞少，有少量空骨陷窝。术后第12周，股骨头内可见骨小梁致密，脂肪细胞形态正常，空骨陷窝少(见图4)。

图1 A组术后第12周HE染色(×200) 图2 B组术后第12周HE染色(×200)

图3 C组术后第12周HE染色(×200) 图4 D组术后第12周HE染色(×200)

2.3 各组不同时间点空骨陷窝率比较 术后第8、12周，C、D两组空骨陷窝率均低于A、B两组(P<0.05)，其中A、B两组间空骨陷窝率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，C、D两组间比较，差异亦无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 4组术后第8、12周空骨陷窝率

3 讨论

因应用激素而导致的SONFH是一种骨科常见病，如未进行有效干预，约80%的患者在发病2～4年后出现股骨头塌陷、变扁，导致髋关节疼痛和功能障碍。现有以保留股骨头为主的各种方法如髓芯减压、带血管蒂的骨移植、血管束植入等,虽然取得了一定的疗效，但其远期效果欠理想。SONFH患者主要以青壮年为主，好发年龄为30～50岁，常累及双髋，病情进展迅速，如未进行有效治疗，大部分患者最终需接受人工全髋关节置换术。由于人工关节假体使用寿命有限，且假体植入后存在感染、松动及假体周围骨折等并发症，如发生上述情况还需进行人工髋关节翻修手术。如此不仅治疗费用昂贵，同时还存在围手术期失血量大、假体植入后因关节周围骨量丢失稳定性差等潜在风险，给患者造成严重的手术创伤和沉重的经济负担。对于该类青壮年患者，如何在早期尽可能保留其自体股骨头，推迟实施人工髋关节置换，甚或逆转乃至治愈SONFH具有重要的现实意义。

SONFH的发病机制目前尚未完全明确。糖皮质激素在进行机体脂肪动员的同时，抑制组织细胞对血液中脂肪的利用，引发高脂血症。同时激素还诱导骨髓干细胞向脂肪细胞转化，加之股骨头内特有的微循环系统，引起股骨头血管内脂肪栓塞和微血栓形成，最终导致骨坏死[7]。因此，应用降脂药物来干预早期SONFH是值得进行的有益探索。他汀类药物为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(3-Hydroxy-3-mothylglutaryl coenzyme A，HMG-COA)还原酶抑制剂，是胆固醇合成的限速酶，已广泛应用于临床来防治高脂血症、冠心病、脑梗死等心脑血管疾病。Nishida等[8]以匹伐他汀对兔早期SONFH进行干预，与激素模型组相比，匹伐他汀组股骨头髓腔内脂肪细胞体积明显减小，数量显著减少，表明匹伐他汀可明显改善SONFH预后。近年来，有研究表明他汀类药物在降脂的同时，可促进新骨形成、增加骨密度[9-10]。他汀类药物口服给药能有效促进SONFH骨组织内相关成骨因子的表达，加速激素性坏死股骨头修复[11-12]。

由于他汀类药物口服后经过肝脏的首过效应，其作用于骨组织中浓度更低，如要达到其有效治疗浓度，势必加大给药剂量，如此该副作用将进一步增加，导致临床应用受限[13]。与系统给药相比，局部给药可明显增加药物在骨组织中浓度，使其更加直接、快捷地作用于病变部位，实际疗效可能会更优。Papadimitriou等[1]制作兔股骨骨缺损模型后，在骨缺损局部植入辛伐他汀，发现其局部应用能明显促进骨缺损修复。Ishihara等[14]以自体髂骨联合负载辛伐他汀的明胶支架植入脊柱融合的大鼠模型中，与自体髂骨联合明胶支架相比，前者脊柱融合率明显提高，表明辛伐他汀局部应用能有效促进术区新骨形成。本研究将负载不同剂量普伐他汀的明胶海绵植入兔激素性坏死股骨头内，观察其干预骨坏死效果。结果表明，A、B两低剂量组内仅有少量新骨形成，空骨陷窝数较多。C、D两较高剂量组中，术后各时间点股骨头内均有较多新生骨组织形成，且随着时间延长，新骨形成逐步增加，与A、B两组相比，空骨陷窝数明显减少(P<0.05)。同期C、D两组空骨陷窝率比较并无统计学差异(P>0.05)，推测可能与局部用药量增加而影响新生血管长入等因素有关，其具体机制还有待深入研究。

综上所述，本实验通过在兔激素性坏死股骨头内局部应用普伐他汀，发现较高浓度的普伐他汀可有效促进新骨形成与骨坏死修复，5mg与10mg剂量效果相似。