宫颈上皮内瘤变和宫颈癌患者阴道微环境因子与阴道菌群的相关性研究

张鹏玲

广东省汕头市潮阳区大峰医院妇产科 515100

宫颈癌是女性生殖系统常见恶性肿瘤，流行病学统计显示全球年新发病例近50万，死亡超30万，发病率与死亡率分别居女性恶性肿瘤第二位和第四位，严重威胁女性健康[1]。人乳头瘤病毒(HPV)是临床证实的宫颈癌及癌前病变独立危险因素，但研究发现多数女性为一过性感染，发展成宫颈癌的概率不超过1%，在女性阴道生态中，可能还存在其他致癌因素或HPV感染协同因素[2]。阴道微环境因子指临床中用以评价阴道微生态的指标，近年随着临床对阴道微生态与女性健康关系的重视，关于阴道微环境因子的研究增多并已经证实其与HPV感染有关[3]。阴道菌群改变也与HPV感染存在相关性，国外有学者证实乳酸杆菌含量低者更易感染HPV，HPV阳性者优势菌群改变，菌群组成更为复杂[4]，但关于阴道微环境因子与阴道菌群关系的研究报道较少。本文现择取我院近年收治病例对此进行分析探讨，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年1—12月在我院妇科就诊的74例女性为观察对象，依据诊断结果分为三组。纳入标准：于门诊接受宫颈癌检查的女性，经阴道镜、TCT、HPV、病理学等临床综合检查，明确有无宫颈病变及病变类型；有至少2年性生活史；对本研究知情同意。排除标准：宫颈病变治疗史；子宫手术切除史；近2周抗生素治疗史、阴道冲洗及用药史；合并全身性感染、恶性肿瘤、免疫系统疾病等。将29例宫颈正常的女性纳入A组，年龄29～63岁，平均年龄(45.9±8.4)岁。将22例临床诊断宫颈上皮内瘤变的女性纳入B组，年龄30～65岁，平均年龄(45.8±9.1)岁。将23例临床诊断为宫颈癌的女性纳入C组，年龄32～64岁，平均年龄(47.6±8.7)岁。三组基线资料两两比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法 采集三组女性阴道分泌物标本，常规清洁外阴，充分暴露宫颈，无菌棉棒至于阴道壁上1/3处，尽可能多的采集分泌物。取无菌塑料软管1个，加入3ml生理盐水，将获取的分泌物标本释放到软管中，充分混匀，送检实验室，检测阴道微环境因子，包括阴道清洁度(Cleanliness，CLE)、阴道酸碱度(Hydrogen ion concentration，pH)、过氧化氢(H2O2)、唾液酸苷酶(Sialidase，SIA)、白细胞酯酶(Leukocyte Esterase，LE)。另外，提出分泌物DNA，以V3～V4通用引物和PCR基因扩增仪进行V3～V4基因扩增，DNA纯化回收PCR产物，利用Qubit 2.0 RNA检测试剂盒，精准定量样本回收的RNA。将各PCR产物以20pmol的浓度混合均匀，行Illumina测序。以97%相似性将序列聚类，分为若干个操作分类单元(OTU)，选择丰度最高的序列作为代表进行生物学信息分析。绘制稀疏曲线，分析测序深度及标本代表性，Shannon指数表示菌群多样性。观察各组阴道菌群分布与阴道微环境因子的关系。

2 结果

2.1 宫颈病变与阴道微环境因子关系分析 统计显示，A、B、C三组CLE、SIA、LE比较差异无统计学意义(χ2=0.961、1.142、1.853，P>0.05)，A、B、C三组pH、H2O2比较差异有统计学意义(χ2=4.142、3.981，P<0.05)，各组因子阳性率及组间两两比较数据见表1。

表1 各组阴道微环境因子阳性率统计

2.2 阴道菌群与阴道微环境因子关系分析

2.2.1 菌群聚集性：经统计，CLE Ⅰ～Ⅱ度(正常)的女性特有OTU(1 145个)多于CLE Ⅲ～Ⅳ度(异常)的女性(6个)；pH≤4.5(正常)的女性特有OTU(43个)少于pH>4.5(异常)的女性(732个)；H2O2(正常)的女性特有OTU(68个)少于H2O2+(异常)的女性(1 129个)；SIA-(正常)的女性特有OTU(7个)少于SIA+(异常)的女性(1 142个)；LE-(正常)的女性特有OTU(33个)多于LE+(异常)的女性(982个)。

2.2.2 菌群分布：统计显示，CLE、pH、H2O2、SIA、LE异常的女性，阴道乳酸杆菌属的菌群占比均不同程度下降，加德纳菌属占比不同程度增加。其中，乳酸杆菌属下降最为明显的是SIA异常者，德纳菌属增加最为明显的是CLE异常者，详见表2。

表2 阴道微环境因子正常与异常女性的阴道菌群

3 讨论

阴道微环境因子与阴道菌群是阴道微生态系统的重要组成部分，维持阴道微生态平衡，对预防女性生殖疾病、保障女性生殖健康具有重要意义。宫颈癌前病变及宫颈癌的发生是多因素长期作用的结果，其中以HPV感染影响最大[5]，在这一过程中，阴道微环境因子与阴道菌群或多或少地发生着作用和影响。本次临床研究发现，不同宫颈病变患者的阴道微环境因子pH、H2O2存在明显差异，宫颈上皮内瘤变与宫颈癌患者pH与H2O2的阳性率更高。有研究发现，HPV适宜弱碱性环境生存和繁殖，阴道pH升高，会增加HPV感染或加重已有HPV感染。而H2O2能够通过催化作用生成阻碍HPV定植与生长的HPV，H2O2水平降低也会增加HPV感染风险[6]。阴道菌群方面，阴道微生态平衡状态下，乳酸杆菌是阴道的优势菌。研究发现，乳酸菌可以维持阴道酸环境，抵御致病微生物入侵[7]。另外，乳酸杆菌可以通过细胞毒性作用干预和抑制宫颈癌细胞，也发挥着调节细胞菌群的作用[8]。本次临床研究发现，阴道微环境因子异常会造成阴道菌群聚集性与分布发生较明显改变，此类女性的阴道菌群较阴道微环境因子正常的女性而言更为丰富，原为优势菌的乳酸杆菌占比明显下降，加德纳菌属、嗜胨菌属、普氏菌属、奇异菌属等菌群占比增加。

研究发现，乳酸杆菌可将阴道上皮的糖原降解为酸性物质，从而帮助维持阴道低pH，而阴道微环境因子异常的患者，阴道乳酸菌含量减少，杂菌增多，不仅会破坏阴道酸环境，也导致机体免疫细胞识别和清除病原体障碍，最终破坏阴道微生态[9]。另有研究发现，HPV阳性女性阴道乳酸杆菌占比较低，使用乳酸杆菌干预宫颈细胞癌，可降低HPV癌基因与细胞周期，提示乳酸杆菌可能干预调控癌细胞，与宫颈上皮内瘤变和宫颈细胞癌的发生和进展存在交互作用[10]。

综上所述，阴道微环境因子状态改变，会引起阴道菌群聚集性与分布发生改变，可能增加宫颈病变风险，加强阴道微环境因子与阴道菌群检测，维持阴道微环境稳定，对预防宫颈病变具有积极作用。