丁苯酞对大鼠冠状动脉微栓塞后心肌炎症反应的影响

黄骏文，周 游，陈志清，覃振柏，李 浪，2，3

冠状动脉微栓塞(CME)指急性冠脉综合征病人动脉粥样硬化斑块自发性破裂后，斑块碎片和脂质等导致血栓成分流向远端微小血管引起微循环堵塞，同时也是经皮冠状动脉介入(PCI)术后的常见并发症[1]。CME可导致心肌损伤，易使冠状动脉发生“慢血流”或“无复流”，严重影响病人预后[2-3]。相关研究表明，炎性因子参与心肌组织局部炎症反应，与CME发生后心肌损伤密切相关[4-5]。丁苯酞(dl-3-n-butylphthalide，NBP)分子式为C12H14O2，与芹菜籽中提取的左旋芹菜甲素结构相同，是人工合成的消旋体。相关研究显示，NBP有抗血小板聚集[6]、清除自由基[7]、改善线粒体功能、减少神经细胞凋亡[8]等多种分子靶点，临床广泛用于治疗缺血性脑卒中。随着研究深入，NBP可治疗心肌缺血再灌注损伤[9-10]、心肌梗死[11]、心力衰竭[12]等。NBP能否减轻CME所致心肌损伤及相关机制尚未明确。本研究观察NBP预处理对大鼠CME后心肌组织炎性因子及心功能的影响，探讨NBP对CME所致心肌损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 无特定病原体(SPF)级雄性SD大鼠，6～8周龄，体重200～250 g，由广西医科大学实验动物中心提供(动物合格证号SCXK桂2014-0002)。实验过程中动物的处置符合医学伦理学要求。

1.1.2 实验药物与试剂 直径42 μm的微栓塞球购自挪威Dyna公司，使用前加入生理盐水，调整密度为3×104/mL。丁苯酞软胶囊购自石药集团恩必普药业有限公司(批准文号：国药准字H20050299)，食用植物油配制浓度为80 mg/mL。逆转录试剂盒及逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)试剂盒购自Monad公司。兔抗鼠白细胞介素1β(IL-1β)、兔抗鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)单克隆抗体、兔抗鼠GAPDH单克隆抗体及荧光羊抗兔二抗购自万类生物科技有限公司。

1.1.3 实验仪器 E-Saote Mylab彩色多普勒B超仪购自意大利百胜公司；NanoDrop分光光度计、StepOnePlus荧光定量PCR仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司；T100 PCR仪、电泳槽、转膜仪及其配件购自美国Bio-rad公司；FluorChem FC3全能型成像系统购自美国Proteinsimple公司；低温离心机购自德国Eppendorf公司；BX50光学显微镜购自日本OLYMPUS公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组与处理 将36只SD大鼠随机分为冠状动脉微栓塞组(CME组)、假手术组(Sham组)、CME+丁苯酞预处理组(CME+NBP组)，每组12只。CME+NBP组术前给予NBP 80 mg/kg连续灌胃7 d。术前按30 mg/kg腹腔注射3 mg/mL戊巴比妥钠麻醉大鼠，手术区域剃毛、消毒，颈正中切口暴露气管，经口气管插管，小动物呼吸机辅助通气，于左前胸中部剪断肋骨进胸，暴露心脏并分离升主动脉，使用血管夹钳夹主动脉根部，CME组和CME+NBP组立即使用注射器从心尖部将0.1 mL微栓塞球混悬液注射至左心室，夹闭10 s后松开血管夹，Sham组注射0.1 mL生理盐水。待心跳平稳后逐层关胸，恒温垫上复苏，待苏醒后拔管脱机，术毕给予青霉素40×104U腹腔注射预防感染。

1.2.2 心功能检查 术后6 h麻醉大鼠，使用心脏彩超仪检测心功能，探头频率为12 MHz，测量左室射血分数(LVEF)、短轴缩短率(FS)、左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD)，测量3个心动周期，取平均值。

1.2.3 组织取材 检测心功能后，腹腔注入戊巴比妥钠麻醉，处死大鼠，立即取出心脏，去除心耳、心房，心尖部用液氮冷冻后置入-80 ℃冰箱保存，采用RT-PCR及免疫印迹法(Western Blotting)检测；心底部置入4%多聚甲醛固定液中浸泡，12 h后取出，石蜡包埋、切片，采用苏木精-伊红(HE)染色，光学显微镜下观察心肌坏死及白细胞浸润情况。

1.2.4 RT-PCR定量测定IL-1β mRNA、TNF-α mRNA表达 取心尖部心肌组织 200 mg，按照Trizol试剂盒说明提取总RNA，并按逆转录试剂盒说明将RNA逆转录为cDNA；按试剂说明设置反应体系及参数，用SYB-RGREENI法检测PCR扩增产物，每个样本均进行复孔检测，结果以2-ΔΔCT法比较。实验引物由Sangon公司合成，IL-1β正向引物：5′-GGGATGATGACGACCTGCTA-3′，反向引物：5′-TGTCGTTGCTTGTCTCTCCT-3′；TNF-α正向引物：5′-CGTCGTAGCAAACCACCAAG-3′，反向引物：5′-GAGGCTGACTTTCTCCTGGT-3′；GAPDH正向引物：5′-TGTGAACGGATTTGGCCGTA-3′，反向引物：5′-GATGGTGATGGGTTTCCCGT-3′。

1.2.5 免疫印迹法检测IL-1β、TNF-α表达 取心肌组织加入RIPA裂解液与蛋白酶抑制剂，置入组织研磨仪中研磨，4 ℃条件下，以12 000 r/min 离心15 min，使用BCA法检测上清液浓度，将各组样品统一定量至10 μg/μL。配制12%的分离胶和5%的浓缩胶，每孔加样5 μL，恒压80 V，Marker分层后升至120 V进行电泳；恒流200 mA，90～120 min湿法将蛋白条带转至PVDF膜，使用5%脱脂牛奶封闭1 h，分别置于IL-1β、TNF-α的1∶1 000一抗4 ℃摇床孵育过夜，次日TBST洗膜后使用1∶10 000荧光二抗室温孵育1 h；TBST洗膜后使用化学发光液显影，全能型成像系统扫膜；使用 Image Jv1.80测量条带灰度值。

2 结 果

2.1 各组大鼠心功能指标比较 与Sham组比较，CME组LVEF和FS下降，LVEDD和LVESD增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与CME组比较，CME+NBP组LVEF和FS升高，LVEDD和LVESD下降，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠心功能比较(±s)

2.2 各组大鼠心肌IL-1β mRNA、TNF-α mRNA表达水平比较 与Sham组比较，CME组IL-1β mRNA、TNF-α mRNA表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与CME组比较，CME+NBP组IL-1β mRNA、TNF-α mRNA表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠心肌IL-1β mRNA、TNF-α mRNA 表达水平比较(±s)

2.3 各组大鼠心肌IL-1β、TNF-α蛋白表达水平比较 与Sham组比较，CME组IL-1β、TNF-α蛋白表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与CME组比较，CME+NBP组IL-1β、TNF-α蛋白表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。详见图1、图2。

与Sham组比较，＊P<0.05；与CME组比较，#P<0.05。图1 各组大鼠心肌IL-1β蛋白表达水平比较

与Sham组比较，＊P<0.05；与CME组比较，#P<0.05。图2 各组大鼠心肌TNF-α蛋白表达水平比较

2.4 各组大鼠心肌HE染色 HE染色显示：Sham组未见微栓塞球及心肌梗死灶；CME组及CME+NBP组均可见血管内微栓塞球，微球周围心肌细胞核溶解或消失，周边细胞水肿、变性，周围可见白细胞浸润和红细胞渗出；与CME组比较，CME+NBP组心肌细胞结构改变及炎性因子浸润减少。详见图3。

图3 各组大鼠心肌HE染色(×200)(箭头所示为微栓塞球)

3 讨 论

有研究显示，CME导致心肌损伤及近期、远期心功能下降，与ST段抬高型心肌梗死病人PCI治疗后1年内心力衰竭死亡率和住院率密切相关[3]。CME后伴炎症反应在多项研究得到证实[13-14]，目前认为CME引起的心肌炎症反应可能是导致心肌收缩功能障碍的主要原因。CME发生后，大量炎症细胞浸润心肌微梗死灶，伴有大量炎性因子释放，导致心肌局部炎症反应，且CME所致炎症不仅局限于微梗死灶及周围，同时激活微循环炎症反应，其他部分“正常”心肌均出现炎性因子表达及炎症细胞大量渗出[15]。炎症反应激活产生大量炎性因子，如TNF-α、IL-1β等，这些炎性因子通过促进心肌细胞凋亡及黏附分子表达等多种途径，导致心肌损伤并引起心肌收缩功能障碍。课题组前期研究发现，CME后LVEF与心肌代表性的炎性因子TNF-α水平呈负相关[16]，给予相关药物(美托洛尔和左西孟旦)治疗后，心肌TNF-α水平下降，心肌收缩功能增强[17-18]，提示CME引起的炎症反应与心肌收缩功能障碍密切相关，减轻CME后炎症反应可能成为改善CME后心肌收缩功能障碍的重要靶点。

NBP具有神经保护作用，主要用于治疗缺血性脑病，相关研究显示，NBP能减轻神经血管炎症，保护神经功能[19-20]。Zhang等[20]研究发现，大鼠缺血再灌注脑损伤后，NBP可抑制白细胞介素6(IL-6)、IL-1β、TNF-α等促炎因子表达，减轻脑损伤。近年来越来越多研究显示NBP对心血管疾病具有保护作用。Bai等[11]研究显示，NBP可抑制大鼠急性心肌梗死后IL-1β、TNF-α表达，减轻炎症反应，抑制心肌细胞凋亡。Qiu等[21]研究显示，大鼠心力衰竭模型中，NBP可抑制TNF-α蛋白表达水平，保护心功能。本研究结果显示，与Sham组比较，CME后6 h大鼠心功能下降，心肌病理切片可见微梗死球，表明CME模型成功建立。NBP治疗后，大鼠LVEF和FS较CME组升高，LVEDD和LVESD下降，提示NBP可改善大鼠CME后心肌收缩功能。与CME组比较，CME+NBP组大鼠心肌炎性因子TNF-α mRNA、IL-1β mRNA及蛋白表达水平降低，说明NBP可抑制CME后炎性因子表达，与Bai等[11-12]研究结果一致。HE染色显示，CME组大鼠微球周围心肌细胞核溶解、消失，周边细胞水肿、变性，周围可见白细胞浸润和红细胞渗出，CME+NBP组微球周围心肌排列较整齐，心肌结构较完整，周围炎性因子浸润减少。

综上所述，NBP可抑制CME后心肌组织炎性因子TNF-α、IL-1β表达，减轻心肌炎症反应，改善CME后心肌收缩功能障碍。本研究局限性为仅观察NBP对CME大鼠近期心功能影响，未观察大鼠远期心功能的情况，可进一步观察NBP对CME大鼠远期心功能影响。本研究为小样本量动物实验，今后需大样本随机对照实验进一步证实结论。