电针智三针对血管性痴呆大鼠Syt-4、IL-18、C3a表达的影响

布雨 魏宇唯 唐中生 林吉 朱世杰 谢高宇

(贵州中医药大学基础医学院，贵州 贵阳 550025)

血管性痴呆(VaD)是指由脑缺血、缺氧、出血、梗死等原因导致的脑血管损伤引发的以学习记忆功能障碍为主的疾病。VaD患病人数逐年上升，严重危害人们的健康〔1〕，但在生活中积极进行防治，VaD是为数不多的可以得到有效控制的痴呆。突触可塑性改变和免疫炎性反应是影响学习记忆能力的重要因素。突触结合蛋白(Syt)-4与突触的活性依赖性调节相关，是海马形成突触可塑性的突触调节蛋白〔2〕，影响学习记忆能力。白细胞介素(IL)-18、C3a均促进炎症级联反应，加重组织损伤程度。课题组在先前实验中证实了电针智三针具有改善VaD学习记忆能力的作用〔3～5〕。在此基础上本实验通过检测电针智三针治疗前后VaD大鼠海马CA1区Syt-4表达和血清IL-18、补体C3a的含量，探讨电针智三针改善VaD学习记忆能力相关突触可塑性和免疫炎性反应的可能机制。

1 材料和方法

1.1实验动物 SPF级健康雄性SD大鼠98只，体重280～300 g，重庆滕鑫比尔实验动物销售有限公司，许可证号：SCXK(军)2013-0011。

1.2器材与试剂 华佗牌电针治疗仪(苏州医疗用品有限公司)；尼莫地平片(亚宝药业)；IL-18和补体C3a的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒(伊莱瑞特)；兔多克隆抗体(北京博奥森生物科技有限公司)；山羊抗兔工作液(北京中杉金桥生物有限公司)；超纯RNA提取试剂盒(康为世纪公司)；荧光染料一步法反转录qPCR试剂盒(Vazyme公司)；透射电子显微镜(日本电子株式会社)；徕卡组织处理机(徕卡微系统有限公司)。

1.3VaD大鼠模型的建立 VaD大鼠模型采用改良的Pulsinelli四血管阻断法(4-VO)建立。用3%戊巴比妥钠进行腹腔麻醉，施行背侧颈正中切口，电凝针烧灼双侧第一颈椎椎动脉，以形成永久性闭塞。再施行腹侧颈正中切口，将双侧颈总动脉分离后穿线备用。24 h后用微动脉夹重复夹闭双侧颈总动脉3次，每次5 min，间隔1 h。在4条血管阻断后2 min内，出现瞳孔散大，虹膜发白判定为模型制作成功。采用随机数字表法将成活的VaD大鼠分为模型组、电针智三针组和尼莫地平组，并设假手术组为对照。假手术组不进行烧灼和夹闭动脉。除去治疗过程中死亡的大鼠，保证每组应有数量。

1.4治疗方法 自模型建立第8天开始连续治疗20 d，每日上午9∶00～11∶00进行一次治疗。电针智三针组选取神庭穴及本神穴，针的规格为28号、25 mm(1寸)，以平刺，进针13 mm(0.5寸)进行针刺操作后连接电针仪，给予连续波20 Hz，20 min。尼莫地平组大鼠每日按20 mg/(kg·d)的用量进行灌胃。模型组和假手术组大鼠按照1 ml/100 g蒸馏水配比标准进行灌胃。

1.5Morris水迷宫检测学习记忆 治疗后第21天进行为期1 w的水迷宫测试。前6 d每日各检测定向航行试验1次，将大鼠按Ⅰ～Ⅳ象限依次从各象限水池壁中点靠池壁边缘放入水中，记录60 s内大鼠从水中爬上站台的时间，超过60 s爬上站台所用的时间也记为60 s；第7天行空间探索试验，记录2 min内大鼠在第三象限游泳时间和穿越平台次数。数据由电脑自动采集。

1.6ELISA检测C3a、IL-18含量 3%戊巴比妥钠麻醉大鼠后，剪断股动脉采血。将全血样品于室温放置2 h或4℃过夜后于1 020 r/min离心20 min，取上清并按照ELASA试剂盒说明进行操作，在450 nm波长处测定各样本OD值，求得各样本C3a、IL-18浓度值，取平均值作为各动物血清C3a、IL-18含量。

1.7Real-time PCR检测海马CA1区Syt-4的含量 取新鲜大鼠海马，用总RNA提取试剂盒提取海马总RNA，引物设计后进行Real-time PCR检测。反应程序：55℃逆转录5 min后，95℃预变性5 min，95℃，10 s，60℃，30 s，循环反应40次。PCR各检测样本的CT值用QuantStudio1Design & Analysis Software软件分析。通过2-△△Ct计算X相对mRNA表达水平。采用引物序列：Syt-4:上游5'-GTCAATTCGGGTTTCAGCCACGTCTGGAGT-3',下游5'-TTGAGATCGTTTGGGCAAAAGCGGCAGTTT-3'。

1.8免疫组织化学法检测海马CA1区Syt-4表达 3%戊巴比妥钠对大鼠进行腹腔麻醉，行心脏灌流固定后，开颅取出大鼠脑组织迅速放入4%多聚甲醛中，经至少24 h浸泡固定后取大鼠海马CA1区，切割成3 mm厚的脑片，经脱水、透明、包埋、孵育和修复。在切片上滴加山羊血清封闭液，室温孵育20 min；再滴加一抗，4℃过夜；滴加二抗，37℃，30 min；磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，每次5 min；使用二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒，显微镜下观测室温2 min时切片显色，蒸馏水对切片进行充分洗涤；并使用苏木素复染，脱水，透明，最后封片。

1.9透射电镜观察海马CA1区超微结构 将大鼠海马组织剪切成1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块，先用3%戊二醛预固定，再用1%四氧化锇固定。使用丙酮按照30%→50%→70%→80%→90%→95%→100%(100%浓度中换3次)的浓度梯度进行脱水。再将样品放入脱水剂和环氧树脂(型号为Epon812)渗透液中渗透40 min，将渗透好的样品包埋、固化，使用超薄切片机将样品切割成50 nm厚的超薄切片。在室温下用醋酸铀和枸橼酸铅一次染色20 min，最后用JEM-1400PLUS透射电镜观察。

1.10统计学分析 应用SPSS25.0软件进行单因素方差分析或非参数检验。

2 结 果

2.1Morris水迷宫结果 经6 d的引导练习后，模型组平均逃避潜伏期比假手术组明显延长(P<0.01)；电针智三针组和尼莫地平组平均逃避潜伏期比模型组显著缩短(P<0.01)，模型组在第3象限活动时间缩短、穿越站台次数显著减少，与假手术组比较有显著差异(P<0.01);电针智三针组和尼莫地平组第3象限活动时间延长、穿越站台次数明显增多，与模型组比较有显著差异(P<0.01)。见表1。

表1 各组平均逃避潜伏期、第3象限活动时间、穿越平台次数

2.2ELISA检测结果 模型组血清IL-18、C3a含量明显高于假手术组(P<0.01)，与模型组比较，电针智三针组和尼莫地平组血清IL-18、C3a含量明显降低(P<0.01)。见表2。

表2 各组血清中IL-18、C3A表达情况

2.3Real-time PCR检测结果 与假手术组比较，模型组海马Syt-4 mRNA表达显著升高(P<0.01),与模型组比较，电针智三针组及尼莫地平组海马Syt-4 mRNA表达显著降低(P<0.01)，而电针智三针组与尼莫地平组之间差异无显著性(P>0.01)，见表3。

2.4免疫组织化学显色结果 阴性细胞呈蓝色，阳性细胞呈黄色或棕黄色不等，底物为白色，背景为淡紫色，阳性产物主要分布在细胞质及细胞间质。Syt-4在假手术组表达罕见，在模型组呈现高表达，在尼莫地平组、电针智三针组表达较少，见表3，图1。

图1 Sy-4显微图像(免疫组化，×400)

表3 大鼠脑组织Syt-4表达情况

2.5各组大鼠海马CA1区超微结构分析 假手术组突触数量丰富且形态完整、清晰，细胞器结构完整；模型组突触数量急剧减少，且突触间隙模糊或消失，突触小泡较少，线粒体肿胀或空泡化，线粒体嵴断裂或消失，细胞核固缩，细胞核膜内陷，呈半月板状和圆月状；电针智三针组突触数量丰富，形态基本清晰完整，突触小泡丰富，细胞核膜皱缩内陷改善不明显，细胞核仁碎裂；尼莫地平组突触结构基本正常，数量较多，线粒体结构完整，细胞核膜内陷较轻，见图2。

图2 透射电镜观察大鼠海马CA1区超微结构(×10 000)

3 讨 论

VaD主要是指由脑血管疾病导致脑组织缺血或出血引起的认知功能损害综合征。有研究表明针刺可以加强经脉之间的联系，激发经气，疏通已损经络，调节脑神经代谢，提高学习记忆能力〔7〕。著名针灸学家靳瑞提出电针智三针治疗VaD，验之临床，收效颇丰〔8〕。智三针所取穴位神庭和本神，均位于前额，是与神志有关的穴位。神庭穴为脑内元神之所藏，是督脉、太阳及足阳明交会穴，督脉络脑和肾，“并于脊里”“入脑”“上巅”，可作为传输精气的主要通路，对督脉经气进行调节。本神是足少阳胆经循经传来的气血交汇之处，是诸神之本，现代医疗常将此穴用于治疗脑血管疾病。电针智三针的作用机制可能是通过电针特定的穴位，刺激了大脑皮质相应投射区，从而起到调节突触可塑性和炎症因子释放的作用，抑制海马神经元损伤和细胞的免疫炎性损伤，以此改善和修复脑功能〔9～11〕。

Syt-4是突触囊泡蛋白的一种亚型，大量存在于中枢神经系统中，在神经递质释放中具有活性。Ferguson等〔12,13〕发现在基因突变小鼠海马中syt-4的缺失表现在小鼠精细运动与记忆能力的下降；七氟烷造成大鼠认知功能损伤后，Syt-4抑制突触前传递并且在海马中的表达升高〔14〕。Syt-4蛋白可调控刺激依赖性膜转运，这可能影响大脑突触的可塑性变化〔15〕。星形胶质细胞谷氨酸释放的最重要的途径是Ca2+依赖的囊泡胞吐作用，Syt-4是星形胶质细胞释放谷氨酸的Ca2+传感器，通过调控Syt-4参与星形胶质细胞谷氨酸释放，使海马相关的某些记忆形式出现异常〔16〕。过度释放的谷氨酸促使N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDA)表达增强，而NMDA是突触可塑性和海马神经元长时程增强效应(LTP)的主要调控者〔17〕，通过影响神经元LTP，最终降低动物学习记忆能力。经证实针刺可以抑制谷氨酸受体的过度表达，从而起到保护神经元的作用〔18〕。在本实验中VaD大鼠海马CA1区Syt-4的表达明显高于正常组，经过电针智三针治疗后伴随着海马CA1区Syt-4表达水平减少，大鼠学习记忆能力明显升高升高。这可能是通过减少Syt-4的表达从而减少Ca2+依赖性谷氨酸的释放，恢复已损伤的神经胶质细胞，起到治疗VaD的作用。

IL-18和C3a是通过介导炎症级联反应参与VaD的多种免疫机制炎症反应过程。IL-18是目前发现在VaD中起重要作用的IL，研究发现脑梗死患者血清中IL-18水平升高，产生的过度炎症反应影响正常细胞的成熟过程，加重脑损伤程度，影响老年人的认知功能〔19〕。而C3a在脑细胞激活及神经炎症中也发挥着十分重要的作用。C3分子作为补体激活途径的枢纽与多种相关因子均有相互作用，C3a作为C3的激活产物研究较少，目前C3与精神分裂症及帕金森病等的相关性引起了学者的广泛注意〔20〕，因此C3a在脑病领域的研究亟待探索和完善。本实验证实了VaD大鼠血清中IL-18和C3a的含量明显升高，电针智三针有效降低IL-18和C3a的含量，可能与减少炎症级联反应的发生有关。

Syt-4表达的升高促进谷氨酸的释放，谷氨酸已被证实具有激活核因子(NF)-κB的作用，NF-κB被广泛认为是典型的炎症信号通路。研究发现C3a与其受体结合后激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族，并促使磷脂酰肌醇激酶3(PI3K)启动，并在质膜上产生第二信使PIP3，PIP3与细胞内含有PH结构域的信号蛋白蛋白激酶B(Akt)和3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶(PDK)1结合，促使PDK磷酸化AKT蛋白的Ser308导致Akt活化〔21〕，最终C3a能够激活PI3K/Akt通路。文献报道Syt-4激活的NF-κB通路与C3a激活的PI3K/Akt通路能够组成一条完整PI3K/Akt-NF-κB、缺氧诱导因子(HIF)-1α通路〔22〕。而在低氧条件下促进HIF-1产生的重要物质正是IL-18〔23〕。HIF-1在长期重度缺氧时可促进缺氧诱导的细胞凋亡。据此推测电针智三针治疗VaD的作用机制可能与PI3K/Akt-NF-κB-HIF-1α通路有关，而Syt-4、IL-18、C3a的作用方式有相通之处并可以相互促进。

电针智三针以突触改变为靶点治疗VaD，不仅促进缺血后突触的的重建与再生增强神经信息之间的传递，还抑制免疫炎性反应对机体产生的继发性损害，为研究VaD的发病机制与治疗提供一个新的思路。综上所述，电针智三针能够显著改善VaD大鼠的学习记忆能力，可能与其降低VaD大鼠海马Syt-4表达和降低大鼠血清IL-18、C3a含量，延缓海马CA1区神经元损伤有关。