清心解瘀方调控巨噬细胞稳定动脉粥样硬化易损斑块的网络药理学研究

赖润民，刘启予，鞠建庆，徐 浩

易损斑块是指动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)斑块中发展迅速、具有血栓形成倾向的不稳定性高危斑块，易成为急性心肌梗死、心脏骤停、恶性心功能衰竭等临床不良事件发生的罪犯病变[1]。以巨噬细胞为首的炎性细胞广泛参与AS的发生发展和易损斑块的形成、破裂，促进急性心血管事件的发生。深入解析巨噬细胞在易损斑块中的作用、探寻有效干预措施始终是AS防治研究的热点和难点。

随着对易损斑块病理机制认识的不断深入，陈可冀院士领衔的科研团队提出“瘀毒致变”是AS易损斑块破裂并引发心血管事件的重要病因病机[2]。大量动物及细胞试验进一步证实活血解毒中药能够通过调控巨噬细胞的极化、自噬、凋亡等过程起到稳定AS斑块的作用[3]。清心解瘀方由黄芪、丹参、川芎、藿香、黄连组成，是针对冠心病“瘀毒”病因病机的代表方，由陈可冀院士治疗心肌梗死的经验方愈梗通瘀汤化裁而来[4]。前期临床及基础研究证实，清心解瘀方可降低稳定型冠心病病人的炎性因子水平、非致死性心肌梗死及“硬终点”事件发生率，并可通过调控巨噬细胞凋亡稳定AS易损斑块[5-7]。然而中药具有多途径、多环节、多靶点综合调节的作用特点，清心解瘀方是否还可通过其他途径调控巨噬细胞、稳定易损斑块，本研究拟运用网络药理学方法进行初步探索。

1 资料与方法

1.1 药物活性成分与潜在靶点筛选 利用北京蛋白质组研究中心开发的生物信息学工具BATMAN-TCM平台(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm)检索清心解瘀方中药物的活性成分，并预测活性成分作用的基因靶点。检索参数设置为Score cutoff≥20，P<0.05。

1.2 易损斑块巨噬细胞相关差异基因获取 从Gene Expression Omnibus数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载编号为GSE41571的基因芯片[8]，该芯片基因表达谱来自于利用激光显微切割技术从人颈动脉组织中分离的富含巨噬细胞的易损/破裂斑块和稳定斑块。使用R软件中的Affy包对原始数据进行背景校正、归一化处理和探针注释。使用limma包对差异表达基因进行提取，利用Benjamini-Hochberg方法对P值进行校正并筛选出P<0.05的差异表达基因。

1.3 药物-活性成分-作用靶点网络构建 获得清心解瘀方活性成分潜在靶点基因及易损斑块巨噬细胞靶点基因后，利用Excel表格取两者交集并进行药物成分靶点-疾病靶点映射，构建药物-活性成分-作用靶点矩阵，并利用Cytoscape 3.2.2软件对矩阵网络进行可视化。

1.4 基因富集分析 将获得的作用靶点基因导入Metascape数据库(http：//metascape.org)进行基因富集分析[9]。以P<0.01，min overlap=3，min enrichment=1.5的参数设置，对获取的靶点进行基因本体(GO)生物学过程富集分析和信号通路富集分析及可视化。

2 结 果

2.1 清心解瘀方调控巨噬细胞稳定易损斑块的活性成分和潜在作用靶点 经BATMAN-TCM平台检索，共获得清心解瘀方活性成分187个和活性成分对应的潜在靶点基因1 686个；对GSE41571基因芯片进行差异表达基因分析，获得易损斑块巨噬细胞相关基因899个。将清心解瘀方靶点基因与差异表达基因取交集后，获得清心解瘀方调控巨噬细胞稳定易损斑块的潜在作用靶点基因87个，具有调控巨噬细胞作用的活性成分110个，其中靶基因数目在10以上的活性成分15个。详见表1。

表1 清心解瘀方调控巨噬细胞稳定易损斑块的主要活性成分

2.2 药物-活性成分-作用靶点网络构建 利用Cytoscape 3.2.2构建清心解瘀方调控巨噬细胞稳定易损斑块的“药物-活性成分-作用靶点”网络图，该网络图共包含202个节点(5个药物，110个活性成分，87个靶点基因)、591条边。深绿色圆形节点代表药物，黄色菱形节点代表活性成分，浅绿色三角形节点代表作用靶点。详见图1。

图1 清心解瘀方调控巨噬细胞稳定易损斑块的“药物-活性成分-作用靶点”网络图

2.3 基因富集分析 将87个靶点基因导入Metascape进行富集分析，结果显示清心解瘀方调控巨噬细胞稳定易损斑块主要涉及的GO生物学过程包括炎症细胞的迁移和增殖、脂质合成代谢、激素参与的代谢过程、细胞程序性凋亡和细胞吞噬的调节及平滑肌细胞增殖等，详见表2；主要涉及的信号通路包括脂质代谢、磷脂酰肌醇-3激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)信号通路、铁死亡、炎症细胞的迁移和细胞吞噬等，详见表3。

表2 清心解瘀方调控巨噬细胞稳定易损斑块涉及的主要GO生物学过程

表3 清心解瘀方调控巨噬细胞稳定易损斑块涉及的主要信号通路

3 讨 论

易损斑块除具有脂质核心大、纤维帽薄、平滑肌细胞和胶原含量少等特点外，炎性细胞和炎症介质水平亦较高。脂质沉积造成AS管腔狭窄与中医药学有关“瘀血”“血脉不通”的认识有相似之处，而AS炎症反应及在此基础上导致易损斑块破裂合并血栓形成过程中所涉及的血管内皮损伤、组织坏死及炎症介质等病理产物，均与中医毒邪学说的内毒或外毒密切相关[10]。在此基础上，大量临床及基础研究进一步证实了中药对巨噬细胞的免疫调控作用[11]。

本研究通过网络药理学方法，探索了针对冠心病“瘀毒”病因病机的代表方清心解瘀方调控巨噬细胞稳定易损斑块的潜在机制。GO生物学过程和信号通路富集分析结果提示清心解瘀方可能主要参与调控巨噬细胞的脂质代谢、迁移与吞噬、凋亡、自噬、铁死亡等过程，从而发挥稳定易损斑块的作用。

脂质代谢紊乱和脂质沉积是AS斑块发生和发展为易损斑块的重要因素。升高的血清胆固醇(TC)水平可影响血管内皮的通透性，以低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)为主的脂质得以逐渐沉积于动脉内膜，伴随而来的巨噬细胞迁移和吞噬则标志着AS斑块正式形成的开始[12]。吞噬了大量脂质的巨噬细胞变为泡沫细胞，成为斑块坏死核心的重要组成部分，因此抗巨噬细胞泡沫化是早期抗AS的重要手段。丹参中的丹参酮ⅡA和水溶性丹参多酚酸盐均可通过下调巨噬细胞中CD36的表达抑制巨噬细胞的泡沫化，减少核心部分的脂质沉积；丹参素、黄芪中的槲皮素和川芎中的川芎嗪均可作用于过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、ATP结合盒转运体A1(ABCA1)等参与脂质代谢的关键基因，增加胆固醇转运、减少脂质积累；黄连中的黄连素可作用于AMPK-SIRT1-PPARγ通路和凝集素样氧化低密度脂蛋白受体1(LOX1)，减少巨噬细胞对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的摄取，发挥抗巨噬细胞泡沫化的作用[13-14]。

AS晚期，巨噬细胞不断凋亡的过程可产生持续的炎症反应，使得坏死核心逐渐扩大，促进了易损斑块的形成[12]。前期研究证实，清心解瘀方可通过调控NLRP3炎症小体活化，抑制巨噬细胞凋亡和炎症级联反应[7]。本研究通过基因富集分析，发现清心解瘀方中的丹参新醌B、异隐丹参酮、2-辛烯酸、雌三醇、刀豆氨酸等成分参与调控了巨噬细胞凋亡的生物学过程。此外，丹参新醌B、异隐丹参酮、丹参酚醌Ⅰ、二氢卡拉酮等和刀豆氨酸、2-辛烯酸等成分还分别参与了PI3K-Akt和铁死亡信号通路。PI3K-Akt与其下游的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是调控巨噬细胞自噬的重要通路[15]，自噬是细胞利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程，在巨噬细胞中具有调节极化功能的作用，可使促炎的M1型巨噬细胞向抑炎的M2型巨噬细胞转化，适度激活可起到稳定斑块的作用[3，16]。

铁死亡是一种铁离子依赖性的、以细胞内脂质过氧化物堆积为特征的新型细胞程序性死亡方式[17]。研究显示，铁过载可促进氧化应激、脂质过氧化等病理过程，从而影响斑块的稳定性。AS斑块中活性铁主要来源于斑块内的微血管破裂后出血、红细胞进入斑块被巨噬细胞快速溶解与吞噬的过程。巨噬细胞内的铁沉积增多，促进泡沫细胞的形成，导致斑块不稳定性增高[18]。尽管目前尚无系统探索巨噬细胞铁死亡与AS相关机制的研究，但已有研究显示铁死亡与免疫反应和炎症密切相关[19]，脂质氧化、铁沉积和斑块内出血等易损斑块的标志性病理改变进一步提示了巨噬细胞铁死亡可能在AS和易损斑块的形成中起到了重要作用[20]。近年来针对铁死亡的研究逐渐增多，有学者提出靶向抑制铁死亡有望成为防治心脏疾病的有效措施[21]。因此，清心解瘀方是否可通过抑制巨噬细胞铁死亡稳定易损斑块，值得进一步深入研究。

综上所述，本研究应用网络药理学方法对清心解瘀方调控巨噬细胞稳定易损斑块的活性成分、作用靶点和信号通路进行了探索性研究，初步发现其主要通过调节巨噬细胞脂质代谢、迁移与吞噬、凋亡、自噬与铁死亡等途径发挥稳定易损斑块的作用，为进一步深入开展清心解瘀方稳定易损斑块的机制研究提供了新的思路和线索。