基于网络药理学探讨黄芪治疗玫瑰痤疮的主要成分及作用机制

康羲，黄莺

(成都中医药大学附属医院，四川 成都 610000)

0 引言

玫瑰痤疮是一种常见于面部的慢性反复发作性疾病，中医称之为“酒糟鼻”。临床可见于各个年龄段，以20-50岁的中年女性为最为多见[2]。本病可见暂时或反复发作的红斑、毛细血管扩张、皮肤敏感等症状，亦可见痤疮样改变，如丘疹、脓疱等，也可累及眼部出现眼干、瘙痒、视物模糊，甚至出现肥厚增生性改变，形成鼻赘等[1]，对患者身心造成极大的痛苦。现代治疗方案多为内外合治，中医中药在内服调理方面有独特的优势。研究发现，本病联合中药治疗可有效缩短疗程，提高疗效，有效减轻患者临床症状。此外还具有副作用低，远期疗效佳等优势。在统计皮肤科名中医黄莺教授治疗玫瑰痤疮的经验方568例中，发现其中黄芪运用次数最多，共计达324次。查阅文献也有许多医家治疗本病使用到了黄芪。黄芪首见于《神农本草经》，在临床应用广泛。中医认为，黄芪性微温，味甘，归肝、肺、肾、脾经。具有补气、固表、利水消肿、托毒排脓、敛疮生肌等功效，临床常用于治疗内伤劳倦、脾虚泄泻、咳嗽、便血、子宫下垂、疮疡久不收敛等以气虚血亏为主证的疾病，为补气健脾之要药[3]。西医研究发现，黄芪的主要成分包括黄芪多糖、黄酮类、皂苷类、氨基酸、微量元素等，以皂苷类为主要有效成分。现代药理研究发现黄芪具有调节免疫、缺血保护、心脏保护、抗炎、抗病毒、抗肿瘤等作用[4]。张小鸿[5]等研究发现，黄芪能有效改善网状内皮细胞的吞噬功能，使血液中白细胞数量增加。赵莲芳[6]等也证实了黄芪能大幅度提高巨噬细胞的吞噬能力。高鹏[7]等则发现不同剂量下的黄芪对巨噬细胞影响不同，具有双向调整免疫的功能。也有研究指出，黄芪多糖能够有效改善患者的疲劳，增强机体耐缺氧能力和应急能力[8]。徐荔[9]等发现，黄芪多糖能抑制LPS诱导的巨噬细胞产生炎症因子，进而提高机体的抗炎症反应。此外吕兴萍[10]等也发现黄芪多糖能抑制金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠埃希氏菌等的生长。可见黄芪有良好的调节免疫及抗炎作用，这些都对玫瑰痤疮有良好的治疗作用。但黄芪成分多，作用靶点繁杂，故找到其有效成分的对应治疗靶点有利于临床探究其作用机制及开展进一步研究。

网络药理学为目前研究热点，可通过数据分析多方面挖掘药物治疗疾病的潜在机制。目前虽通过中医理论系统及临床应用证明了黄芪在玫瑰痤疮治疗中的有效性，但尚未明确其主要有效成分及机制。故本研究将通过网络药理学，筛选药物有效活性成分，并建立“药物-活性成分-靶蛋白-疾病”网，分析其作用靶点，寻找黄芪治疗玫瑰痤疮的潜在机制，为后续进一步研究提供基础。

1 方法

1.1 筛选黄芪有效活性成分及玫瑰痤疮靶蛋白

通过TCMSP数据库(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)收集黄芪有效成分，以OB (生物利用度)>30%，DL (药物相似度)>0.18为筛选条件，得到黄芪有效活性成分共20个，查询其对应靶点，共143个。在Gene Cards数据库(https://www.Genecards.org/)、OMIM数据库(https://omim.org/)检索玫瑰痤疮及皮肤病的相关疾病靶点，获得靶点共545个，与黄芪有效成分的靶点取交集，得到靶点37个。使用 Cytoscapev 3.8.2软件构建“药物-活性成分-靶蛋白-疾病”可视化联系。

1.2 构建蛋白-蛋白相互作用网络(PPI)

将1.1中获得的交集靶点及对应成分分别导入String数据库(https://string-db.org/cgi/)，获得“药物-活性成分-靶蛋白-疾病”网，并分析构建蛋白-蛋白相互作用网络(PPI)。按Degree由大到小排序，选择前30位靶点为潜在核心靶点。

1.3 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

将1.2筛选出的核心靶点导入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)，以人类为研究对象进行GO (gene ontology)注释和KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析，并设置将P值小于0.01。其中GO分析包括生物过程(BP)、细胞成分(CC)和分子功能(MF)。

2 结果

2.1 黄芪有效成分及靶蛋白分析

通过TCMSP数据库检索“黄芪”，以OB (生物利用度)>30%，DL (药物相似度)>0.18为筛选条件，得到黄芪有效活性成分共20个(详见表1)，查询有效活性成分对应的靶点，共得到143个靶点。在Gene Cards、OMIM数据库中分别检索rosacea (玫瑰痤疮)、skin (皮肤)，将所得靶点整合统计取并集后，共得到545个靶点。通过PERL将黄芪有效活性成分靶点与疾病靶点取交集，共获得37个靶点(详见图1)，对应13种活性成分。主要包括华良姜素，常春藤皂苷，异鼠李素，美迪紫檀苷，7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇，(6aR,11aR)-3羟-9，10-二甲基氧紫檀-3-O-b-D-葡萄糖苷(黄酮类化合物)，联苯双酯，O-甲基异黄酮，毛蕊异黄酮，槲皮素，山奈酚及1,7-Dihydroxy-3,9-dimethoxy pterocarpene。其中Degree排名前五位成分为槲皮素、山奈酚、7-O-甲基异木糖醇、异鼠李素、毛蕊异黄酮(详见表2)，这些可能为黄芪治疗玫瑰痤疮的关键有效成分。通过Cytoscapev 3.8.2软件构建“药物-活性成分-靶蛋白-疾病”网络(详见图2)。

图1 Venny图

图2 黄芪治疗玫瑰痤疮的“药物-活性成分-靶蛋白-疾病”网

表1 TCMSP数据库检索“黄芪”有效成分

表2 黄芪关键有效成分

2.2 构建蛋白-蛋白相互作用网络(PPI)

将重合的37个靶点导入String数据库(https://string-db.org/cgi/)获得“药物-活性成分-靶蛋白-疾病”网，并构建蛋白-蛋白相互作用网络(PPI)(详见图3)。按Degree由大到小排序，筛选出前30个作为潜在核心靶点(详见图4)。将核心靶点对应的有效成分与2.1所获得的黄芪治疗玫瑰痤疮可能有效成分取交集，获得潜在有效成分13个，按Degree大小排序，推测槲皮素、山奈酚、7-O-甲基异木糖醇、异鼠李素、毛蕊异黄酮为黄芪治疗玫瑰痤疮的关键有效成分。

图3 黄芪治疗玫瑰痤疮靶点PPI图

图4 Degree前30个靶蛋白

2.3 基因功能及通路分析

通过DAVID数据库对筛选出的黄芪治疗本病的30个核心靶点进行分析，根据P<0.01，共得到56个GO注释，113个KEGG通路。按P值大小，筛选出前20个GO注释(详见图5)。

图5 黄芪治疗玫瑰痤疮核心靶点GO注释

表中GO注释6个与BP有关，14个与MF有关，提示GO注释大多与BP、MF相关，如细胞因子受体结合、细胞因子活性、受体配体活性、信号受体激活剂活性、细胞粘附分子结合等。

KEGG结果则提示这30个核心靶点主要富集在34条通路上，主要集中于AGE-RAGE信号通路、流体剪应力与动脉粥样硬化、脂质与动脉粥样硬化、IL-17信号通路、Th17细胞分化、肿瘤坏死因子信号通路、PI3K-Akt信号通路、冠状病毒病、MAPK信号通路、肺结核、甲型流感、HIF-1信号通路等。按P值大小排列，筛选出前20条通路，详见图6、7。

图6 黄芪治疗玫瑰痤疮核心靶点KEGG通路分析

3 讨论

3.1 黄芪治疗玫瑰痤疮的关键有效成分

图7 KEGG通路分析

近年来，有许多文献及医家经验验证了黄芪应用于玫瑰痤疮的有效性，研究显示，黄芪能有效改善患者临床症状，缩短疗程。但关于黄芪治疗玫瑰痤疮的关键有效成分及作用机制均无相关文献报道。本研究通过网络药理学完善了“药物-活性成分-靶蛋白-疾病”网，并构建了蛋白-蛋白相互作用网络(PPI)，结果得到黄芪的13种活性成分，分别对应37个作用靶点。根据Degree筛选出前5种成分作为关键有效成分，即槲皮素、山奈酚、7-O-甲基异木糖醇、异鼠李素、毛蕊异黄酮。其中槲皮素及山奈酚最有可能作为核心有效分子起治疗作用。槲皮素是天然黄酮化合物，研究发现槲皮素具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、抗菌、抗炎及神经保护等多种作用，而调节炎症是其最核心最显著作用之一[11]。目前已有很多研究证明槲皮素在体外体内均可抑制炎症细胞因子及相关酶，进而产生炎症抑制作用。虽然槲皮素生物利用度较低，易转化为各类衍生物，但其抗炎效益并未因此衰减[12]。周霄楠[13]等在使用槲皮素处理脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞瘤细胞系细胞炎症模型中发现，槲皮素可降低炎症因子IL-1、IL-6、IL-10的表达。Kleemann R[14]等也证实槲皮素可通过降低IL-1R、Ccl8、IKK、STAT3等炎症因子的基因表达来改善血管炎症。此外槲皮素也是一种植物源杀菌剂，在体内外有较强的抑菌作用，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、肠球菌和沙门氏菌等均有良好的抑制性[15-16]。王兆东[17]等则发现槲皮素可通过雌激素受体/β-catenin/c-Myc信号通路促进表皮干细胞增殖，进而促进皮肤创口的修复。山奈酚也是黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗癌等多种功能[18]。Kowalski J[19]等研究显示，山奈酚能抑制巨噬细胞的表达，减少释放IL-1β、TNF-α等炎症因子。也有研究发现，山奈酚能显著抑制LPS诱导的人单核细胞THP-1的MAPK通路的表达，降低MDC、IP-10、IL-8等炎症因子的产生[20]。此外，山奈酚还具有免疫抑制作用，可以有效减少T淋巴细胞过度活化和增殖[21]。

目前主流思想认为玫瑰痤疮发病是由综合因素所致，以免疫机制、炎症反应及屏障破坏为主要发病机制。玫瑰痤疮患者皮肤常见IL-1、IL-6等炎症介质释放增加，伴随蠕形螨及多种细菌感染[22]。Brown[23]等也发现玫瑰痤疮患者局部皮损有大量T细胞及B细胞浸润，提示免疫因素也诱发加重本病。槲皮素及山奈酚均有良好的抗炎抗菌作用，而槲皮素还可促进表皮干细胞增殖，可促进表皮修复。山奈酚抑制T细胞过度活化也可一定程度上减轻症状。两者在治疗玫瑰痤疮上均有一定理论基础，有很好的应用前景。其余几种成分在皮肤疾病方面报道较少，故暂不考虑作为主要有效成分探究，本研究可为后期深入探讨黄芪治疗玫瑰痤疮的有效成分作为理论参考。

3.2 黄芪治疗玫瑰痤疮的核心靶点

对黄芪治疗中涉及的37个核心靶点进行PPI网络构建分析，按Degree大小筛选出前30个核心靶点(详见图2)，主要包括血管内皮生长因子-A (VEGFA)、白介素-6(IL-6)、白介素-1B (IL-1B)、丝裂原激活蛋白激酶8(MAPK8)、白介素-8(IL-8)、表皮生长因子受体(EGFR)、白介素-4(IL-4)、干扰素(IFNG)、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(CASP3)等，故推测这些靶点可能在黄芪治疗玫瑰痤疮中发挥重要作用。VEGF是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，而VEGFA是其中典型成分，可促进新生血管形成及使血管通透性增加。基因学研究发现，玫瑰痤疮患者参与血管调节及某些神经源性炎症的相关基因有大幅度的上调，表现出血管收缩的不稳定[24]。Anatte[25]等研究发现玫瑰痤疮患者皮损处表皮及上皮细胞可见VEGF受体表达增加。目前研究证也发现，玫瑰痤疮患者表现出IL-18等因子下调，IFN-γ高表达，以及IL-1、IL-6、TNF-α等炎症介质释放增加[22]。而槲皮素及山奈酚均有抑制多种炎症因子等作用，故这些靶点可能是探究黄芪治疗玫瑰痤疮的关键。

3.3 主要富集通路

GO功能注释分析结果显示黄芪可能在细胞因子受体结合、细胞因子活性、受体配体活性、信号受体激活剂活性、细胞粘附分子结合等方面起关键作用，发挥促进机体免疫功能，减轻炎症等作用。KEGG通路结果提示黄芪靶点主要富集于流体剪应力与动脉粥样硬化、脂质与动脉粥样硬化、AGERAGE信号通路、IL-17信号通路、乙型肝炎、Th17细胞分化、肿瘤坏死因子信号通路、冠状病毒等通路上。这些通路都较为复杂，包括多个下游通路。其中显著性最高的流体剪应力与动脉粥样硬化通路中，涉及到了VEGFR (内皮细胞生长因子)、VCAM-1(血管细胞粘附分子-1)、IL-1(白介素-1)、IFN-γ (干扰素-γ)、TNF-α (肿瘤坏死因子-α)等分子，有研究证实玫瑰痤疮的发病与这些炎症介质密切相关[22]。Yıldız Hayran[26]等采用通道对照试验也证实了VFGF基因+405C/G多态性将增加玫瑰痤疮的风险。此外也有研究提出玫瑰痤疮与心血管疾病的某些风险因素显著相关，包括高血压、血脂异常及代谢综合征[27]，故脂质与动脉粥样硬化通路与玫瑰痤疮的发病也可能有一定关联性。AGE-RAGE信号通路虽是糖尿病相关通路，但可刺激产生大量黏附分子、生长因子、促炎细胞因子(如IL-6、IL-8、TNF-α) 等，引起慢性细胞活化和组织损伤，导致细胞凋亡、炎症产生。此通路还可促进VCGF生成，引起血管通透性增加[28]。IL-37又称抗菌肽，是玫瑰痤疮发病中的关键因素，既可以诱发VEGF高表达，引起血管活性和白细胞趋化活性的作用；又增加IL-1β的释放，协同发挥血管活性作用，而活化的IL-1β可进一步诱导IL-8、TNF、COX-2增加，引起炎症反应[22]。Buhl[23]等在转录组研究中也发现玫瑰痤疮患者的Th1细胞因子、IFN-γ、TNF-α的相关基因及 Th17细胞因子IL-17A、IL-22相关基因均呈现出普遍高表达。故上述通路均与玫瑰痤疮的发生发展密切相关。

综上所述，本文通过网络药理学对黄芪治疗玫瑰痤疮的主要有效成分及作用机制进行了初步分析，发现其具有多靶点、多通路、多成分的特点，初步阐述了黄芪治疗玫瑰痤疮的核心活性成分，潜在作用靶点及通路，靶点之间的相互联系等，为下一步研究黄芪治疗玫瑰痤疮提供了思路及理论基础，也有助于指导临床药物的使用。