猪伪狂犬病病毒TK/gE/gI缺失株的构建及与Montanide Gel 01佐剂联合免疫效果评价

颜志斌，陈美静，唐 栋，任小波，吴晓燕，纪秋云，刘家齐，何淑菲，琚春梅 (华南农业大学 兽医学院 广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室，广东 广州 510642)

伪狂犬病病毒(PRV)属于疱疹病毒科，α疱疹病毒亚科，水痘病毒属[1]。PRV可引起妊娠母猪流产、成年猪的呼吸系统疾病及仔猪的神经系统疾病甚至死亡[2-4]。自2011年以来，在接种了Bartha-K61疫苗的猪群中出现了伪狂犬病(PR)的暴发[5]。经基因组测序研究发现，本轮PR暴发是由新的变异毒株所引起[6]。同时有研究表明，Bartha-K61疫苗不能对新的PRV变异株提供完全有效的保护[7]。因此，迫切需要研发更有效的针对PRV变异株的疫苗以提高猪群的抵抗力。

TK基因是PRV的主要毒力基因，同时也是病毒增殖的非必需基因，缺失后不但可使病毒的毒力大大降低，而且对病毒的增殖特性影响很小[8]，因此可以通过缺失TK基因来制备PRV弱毒疫苗。同时，通过添加适当的佐剂，可以使疫苗的免疫效果显著提升。本试验选用的佐剂Montanide Gel 01(MG01)是一种聚合物佐剂，现有研究表明，牛疱疹病毒、大肠杆菌、猪繁殖与呼吸综合征病毒的疫苗与MG01联合使用时，其免疫效果明显增强[9-11]。

1 材料与方法

1.1 毒株与试剂PRV gE/gI双基因缺失突变株rPRV-AH-gE-/gI-为前期研究中所构建[12]。PRV流行毒株PRV-AH[13]、BHK-21细胞、EscherichiacoliDH5α、pEGFP-N1质粒均由华南农业大学兽医学院微生物学教研室保存。限制性内切酶EcoRⅠ、EcoRⅤ、PstⅠ、Hind Ⅲ及pMD18-T均购自TaKaRa公司；转染试剂Lipofectamine 2000 Reagent 购自Invitrogen公司；低熔点琼脂糖购自Sigma公司；病毒DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、去内毒素质粒提取试剂盒均购自Omega公司；……