17p13.3微缺失/微重复与胎儿临床表型差异的遗传学分析
——附五例报告

杨滢，朱湘玉，王景美，荆秀娟，顾雷雷，刘威，王皖骏，王亚平，李洁

(1.南京大学医学院附属南京鼓楼医院 妇产科，江苏 南京 210008； 2.南京大学医学院附属南京鼓楼医院病理科，江苏 南京 210008； 3.南京大学医学院 医学遗传学研究室，江苏 南京 210093)

17p13.3单倍体不足或重复与罕见遗传病表型发生相关。根据异常染色体片段所含的关键基因不同，17p13.3区域微缺失或重复引起的主要表型异常分为米勒·迪克综合征(Miller- Dieker syndrome，MDS)、孤立性巨脑回畸形(isolated lissencephaly sequence，ILS)[1- 3]、17p13.3微重复综合征Ⅰ型和17p13.3微重复综合征Ⅱ型[4- 6]。

基因型- 表型关联分析研究表明，17p13.3区域是智力残疾、颅面缺损、癫痫和一些罕见症状的致病区域。本研究采用染色体微阵列分析(chromosome microarray analysis, CMA)发现5个病例17p13.3区域微小基因组拷贝数改变，通过实时荧光定量PCR(quantitative real- time polymerase chain reaction, q- PCR)和荧光原位杂交技术(metaphase fluorescenceinsituhybridization, FISH)，对异常片段的亲本来源进行检测，探讨该区域遗传物质不均衡与临床表型的关系。

1 资料与方法

1.1 病例一般资料

本研究的5个病例来自南京大学医学院附属南京鼓楼医院产前诊断中心，患儿亲属均签署了遗传学检查知情同意书。其中病例1、2和3是经腹穿刺的羊水标本，病例4是流产胚胎，病例5是引产胎儿皮肤组织。

1.1.1 病例1 G1P0，孕22周，单绒毛膜双羊膜囊双胎之一(选择性生长受限 Ⅱ 型，胎儿镜下行减胎术后所留胎儿)。胎儿左侧侧脑室后角10.4 mm，右侧侧脑室后角9.2 mm，胎儿大小符合孕周。父母非近亲婚配，自然妊娠，孕期未接触有毒或致畸剂，无明显遗传病家族史。

1.1.2 病例2 G1P0，体外受精(IVF)胎儿，孕22周，超声检查胎儿大小符合孕周，有先天性心脏病室间隔缺损(ventricular septal defect, VSD)(图1A、B)，父母非近亲婚配，IVF妊娠，孕期未接触有毒或致畸剂，无明显遗传病家族史。

图1 病例2胎儿超声心动图检查结果 A.VSD，箭头所指为室间隔近左室流出道处见回声失落；B.箭头所指为穿隔血流信号。RV为右心室，LV为左心室，AO为主动脉

1.1.3 病例3 G2P0，20周胎儿，因孕妇外周血胎儿游离DNA产前检测(noninvasive prenatal test，NIPT)提示17p13.3缺失行羊膜腔穿刺，超声检查胎儿生长发育符合孕周。父母非近亲婚配，此次系自然妊娠，孕期未接触有毒或致畸剂。孕妇2018年因胎儿先天性心脏病引产1次。孕妇本人顺产所生，1岁说话，1岁走路，初中毕业。身高160 cm，体重63 kg，头围 55 cm，有轻微特殊面容(双眼略下斜，鼻梁塌陷宽大，短鼻，鼻孔略上翻，双耳位低，上唇肥厚，嘴角下弯)，双手掌纹无特殊，无双侧小指内弯，与人交流略差，生活可自理，轻度智力低下[根据心理教育评定量表(psycho- educational profile，PEP)评估]。配偶无特殊面容，孕妇及配偶胸部CT、腹部超声、超声心动图、血常规、肝肾功能均未见明显异常。家系其他成员无特殊表现。

1.1.4 病例4 G3P0，孕10周稽留流产组织。孕妇2017年人工流产1次，2018年胚胎停止发育1次(原因不明)。

1.1.5 病例5 G1P0，孕23周引产胎儿，女性，因孕22周超声检查提示腹围相当于20+周(图2A)、左心发育不良综合征、左心偏小(图2B)、主动脉瓣及瓣后狭窄(图2C)、心轴左偏(图2D)而引产。引产儿尸检：体重446 g(体重过轻，小于第1百分位数区间)，其余各项生长参数符合23周胎儿。面容轻度异常(双眼线下斜，鼻梁塌陷，宽大，短鼻，鼻孔略上翻，双耳位低，上唇肥厚)(图3A、B)。未见第5指内弯。左心发育不良(左心室约为右心室1/3大小)，主动脉狭窄(主动脉周径0.6 cm，肺动脉周径1.2 cm)，主动脉弓离断(降主动脉与主动脉弓不连续)。头部与神经系统无特殊表现。镜下观察各重要脏器无特殊表现。胎儿父母非近亲婚配，系自然妊娠，孕期未接触有毒或致畸剂。男方(父本)的姐姐32岁，智力低下，记忆力差，月经未潮；男方母亲有3次人工流产史。

图2 病例5胎儿超声检查阳性结果 A.腹围151.9 mm(相当于20+周)； B.四腔心切面，左心明显小于右心； C.主动脉瓣瓣环径1.96 mm，升主动脉内径2.84 mm； D.心轴左偏。GA为孕周，RA为右心房，LA为左心房

图3 病例5 引产胎儿外观 A.大体观； B.面部侧面观，轻度异常面容，耳位低

1.2 实验方法

1.2.1 CMA检测 在超声引导下，采集病例1、2、3中孕期羊水10 ml，同时采集胎儿父母的新鲜外周血1 ml(EDTA抗凝)，病例4的样本为稽留流产的绒毛10 g，病例5的样本为引产胎儿的皮肤0.5 cm2大小。采用全基因组DNA提取试剂盒(Qiagen，德国)抽提DNA。病例3的母亲存在轻度智力低下以及轻微的特殊面容，进一步应用CMA检测技术对病例3的父母进行检测。常规抽提DNA，应用Cyto scan 750 k芯片(Affymetrix，美国)进行全基因组芯片杂交。查阅PubMed数据库、DGV 数据库(database of genomic variants)、Decipher数据库(database of chromosomal imbalance and phenotype in humans using ensemble resources)、在线人类孟德尔遗传数据库(online mendelian inheritance in man，OMIM)对检测结果的致病性进行分析。

1.2.2 异常片段亲本来源分析 根据CMA检测结果以及各家系临床表现，选用不同的检测技术进行异常片段的验证和判断其来源。

q- PCR(SYBR Green法)：设立正常对照(经过CMA检测验证的正常男性DNA标本)。根据病例1、2、3的异常片段设计引物，选取片段内基因2个，片段外基因1个(PMP22)，引物设计采用Primer 3工具。试验仪器采用StepOnePlusTMq- PCR系统(Life Technologies，美国)，内参为DNA拷贝数稳定的GAPDH基因。qPCR引物见表1。

表1 q- PCR引物序列

病例4和5均存在多个片段的异常，涉及除17p13.3缺失外的其他染色体重复，根据CMA检测结果，分别选用商品化探针(17p13.1，17号ter、10号ter、6号ter)，应用FISH检测技术对病例4、5父母的外周血染色体进行FISH检测，判断是否存在染色体结构异常。

2 结 果

2.1 CMA检测结果及亲本来源分析

见表2。

表2 CMA检测结果及亲本来源分析

5例17p13.3区域DNA片段拷贝数异常病例中，17p13.3微重复综合征(Ⅱ型)1例(病例1)，临床意义不明的染色体拷贝数变异(variants of unknown significance，VOUS)1例(病例2)，MDS综合征3例(病例3、4、5)。病例1的17p13.3微重复为新发突变，17p13.2 p13.3微重复为母源；病例2的17p13.3微重复为母源；病例3的17p13.3微缺失为母源(CMA检测验证)；病例4存在6p25.3 1.5 mb重复，17p13.3p13.2 3.98 mb缺失，17p13.2p12 8.17 mb重复，为新发突变。病例5存在10q26.12 q26.3 13.67 mb重复，17p13.3 2.27 mb缺失，来源于t(10；17)的父亲。

2.2 结局随访

病例1、3、5选择了终止妊娠。病例2足月顺产男孩，出生后因VSD行修补手术，目前1岁半，生长、运动发育正常。病例4为早期胚胎停止发育。

3 讨 论

在人类染色体中，17号染色体DNA(基因)序列存在较高密度的重复片段，且包含的基因较多。在17p区域，超过23%的部分是由低拷贝重复序列(low copy repeat，LCR)组成[7]。LCR的存在为非等位同源重组(non allelic homologous recombination，NAHR)的发生提供了可能[8- 10]。染色体17p13.3内发现的较高密度LCR使其成为“重组热点”，因此在此区段更容易发生NAHR，导致该区域遗传物质出现缺失和重复。

17号染色体的不稳定性导致了多种疾病，包括脑形态障碍、精神疾病、癫痫和肿瘤的发生[9，11- 13]。17p13.3区域存在4种主要致病性异常，分别是MDS、ILS、17p13.3微重复综合征Ⅰ型和Ⅱ型。位于染色体17p13.3上的PAFAH1B1、YWHAE和CRK基因是区分的关键。PAFAH1B1基因(601545)编码血小板活化因子乙酰水解酶细胞内Ⅰb亚型的非催化亚单位，其缺失导致经典型无脑回畸形[2]。YWHAE基因(605066)编码14.3.3蛋白，在神经元迁移和轴突生长中起调节作用。CRK基因(164762)编码受体信号蛋白，参与颅面发育和神经元迁移[14- 15]。

17p13.3区域的微重复/微缺失综合征为罕见疾病，其临床表型的大部分信息是基于对个案分析获得。本研究中的5例胎儿/胚胎和病例3的母亲均涉及17p13.3区域的微缺失或微重复，根据所涉及的关键基因(PAFAH1B1、YWHAE、CRK基因)，对5个病例的CMA检测结果进行了分析及遗传学诊断(表2)。检出多为MDS(4例：病例3及其母亲、病例4、病例5)，其中1例MDS病例涉及了PAFAH1B1基因(病例4，早期胚胎停止发育)，其余3例来自2个家系，均未涉及PAFAH1B1基因，考虑为PAFAH1B1远端的MDS。病例1为17p13.3微重复综合征Ⅱ型，病例2 为VOUS。

文献中有关PAFAH1B1远端MDS的相关研究较少[2，5，16- 23]，国内见2篇报道[16，23]，涉及28个病例[16，20，23]。将本研究中提供详细表型的病例3、病例3的母亲及病例5与检索获得的病例进行了整合分析(计31例)，其中面部异常26例(主要面部特征包括鼻根宽大、短鼻、鼻孔上翻、大而突出的上嘴唇、低耳位)，5例未提供信息；轻中度智力低下24例，7例胎儿无法提供信息；神经系统未见明显异常12例，脑白质异常14例，未提供信息5例，胎儿期表现为明显异常的2例；宫内发育迟缓13例，出生后生长发育迟缓22例；其他系统未见明显异常17例，先天性心脏病6例(动脉导管未闭3例，VSD 2例，左心发育不良1例)；第5指内侧弯8例。提示，相较于其他的MDS患者，PAFAH1B1远端的MDS症候群患者存在MDS的面容特征，但临床表现相对较轻，可以没有明显的神经系统结构异常。基于检测手段的局限性，绝大部分该类患者在胎儿期缺乏特征性表现。

病例4是稽留流产标本，CMA检出6p25.3 1.5 mb重复，17p13.3p13.2 3.98 mb缺失，17p13.2p12 8.17 mb重复，系新发。6p末端微重复以及17p13.2p12重复的相关研究报道极少，截至2021年4月，Decipher 数据库中仅有3例类似片段的6p末端重复相关病例(290372、314724、386921)，2例类似片段的17p13.2p12重复病例(394097、396211)，且均无早期胚胎停止发育的临床表现。关于MDS患者早期胚胎停止发育研究报道有4例[24- 27]，但相互之间观点存在差异。其中一项研究分析了14个涉及MDS的家族中妊娠情况，研究显示MDS胎儿的自然流产率与人群自然流产率没有显著差异[25]。病例4异常片段所涉及的基因包括6p25.3重复区域中的FOXQ1(612788)、FOXC1(601090)，17p13.3p13.2缺失区域中的MNT(603039)、PAFAH1B1(601545)、CLUH(616184)、P2RX5(602836)、HASPIN(609240)，以及17p13.2p12区域中的PFN1(176610)、CTDNEP1(610684)、KCTD11(609848)、TP53(191170)、KDM6B(611577)。鉴于上述基因在胚胎发育中的重要作用，其拷贝数异常可能与病例4早期胚胎停止发育的发生有关。

病例5除MDS常见面部异常外，存在左心发育不良综合征，体重过轻。CMA检出10q26.12q26.3 13.67 mb重复，17p13.3 2.27 mb缺失，来源于其携带t(10；17)平衡易位的父亲。考虑10号染色体和17号染色体的不平衡现象是其家中其他智力低下患者的致病原因。与本中心已报道的MDS患儿及其同胞MDS胎儿[16]的10q26.13q26.3 9.73 mb重复、17p13.3 1.68 mb缺失相比，两者所涉及的遗传物质异常区段存在相似性，而临床表现存在差异(已报道的病例无先天性心脏病的临床表现)。Decipher数据库中涉及左心发育不良的17p13.3缺失病例仅有1例(395121)。病例5同时存在10p26区域拷贝数异常，涉及ATE1基因(607103)。Kwon等[28]证明，在ATE1基因敲除的小鼠胚胎心脏中，约90%左右心室心肌发育不良。因此考虑病例5携带的10p26末端部分三体可能参与了其左心发育不良的形成。

本研究依托于多种遗传学检测方法，明确了5例胎儿的遗传学基础以及亲本来源，为遗传咨询提供了确切的遗传学证据。对4例MDS患者的表型和基因型进行了相关分析，为PAFAH1B1远端的MDS症候群提供了新的案例。